Instituto Estatal de Investigación en Nutrición de la Academia Rusa de Ciencias Médicas, Moscú
La ocratoxina A, un metabolito secundario de mohos microscópicos muy extendidos de los géneros Penicillium (P. verrucosum) y Aspergillius (A. ochraceus), se encuentra entre las micotoxinas prioritarias: contaminantes alimentarios y representa un peligro real para la salud humana. La ocratoxina A tiene efectos nefrotóxicos, cancerígenos, teratogénicos, inmunotóxicos, neurotóxicos, genotóxicos y citotóxicos pronunciados. La ocratoxina A está clasificada como posiblemente cancerígena para los seres humanos (Grupo 2B) por la Agencia Internacional para la Investigación del Cáncer (IARC). Cuando se administra por vía oral, la LD50 varía según diferentes tipos animales de 20-30 mg/kg de peso corporal (para ratas) a 1 mg/kg de peso corporal (para cerdos). La ocratoxina A se considera uno de los factores etiológicos de la nefropatía endémica de los Balcanes, una enfermedad renal grave registrada en algunos países orientales. paises europeos ah (en particular Bulgaria, Rumanía, Serbia, Croacia, Bosnia y Herzegovina, Eslovenia, Macedonia). La ocratoxina A se encuentra con mayor frecuencia en productos de cereales, café y especias. EN últimamente Hay pruebas de una contaminación significativa de frutos secos, vino y zumos de frutas con ocratoxina A. Así, como resultado de estudios realizados en países de la UE, se encontró que aproximadamente el 70% de los lotes de productos de cereales contenían ocratoxina A en el rango de 0,00001 a 0,041 mg/kg, aproximadamente el 60% de los lotes de vino estudiados estaban contaminados. con ocratoxina A en cantidades de 0,000003 a 0,016 mg/l. Particularmente dignos de mención son los datos sobre la detección frecuente de ocratoxina A en la sangre, así como en la leche materna, en la población de muchos países europeos, lo que indica la ingesta constante de esta micotoxina en el cuerpo humano. Los principales contribuyentes a la ingesta de ocratoxina A a través de los alimentos son los cereales (44%), el vino (10%) y el café (9%). Recomendado por el Comité Mixto FAO/OMS de Expertos en aditivos alimentarios(JECFA) la ingesta semanal tolerable de ocratoxina A es de 100 ng/kg/m. T. . El contenido de ocratoxina A en los países de la UE está regulado en un nivel de 0,005 mg/kg en materias primas alimentarias y 0,003 mg/kg en productos alimenticios. No existen datos fiables sobre la contaminación de alimentos con ocratoxina A en la Federación de Rusia.
El método para determinar la ocratoxina A en productos alimenticios, desarrollado previamente para las necesidades del servicio sanitario y epidemiológico de la URSS, que utiliza la distribución líquido-líquido para purificar el extracto, tiene varias desventajas: sensibilidad relativamente baja del método (límite de detección - 0,001 -0,002 mg/kg), duración significativa del análisis, así como la necesidad de utilizar gran cantidad disolventes orgánicos clorados.
Hasta la fecha, nuevos más métodos efectivos Determinación de ocratoxina A en productos alimenticios basada en el uso de extracción en fase sólida (SPE). SPE se caracteriza por una buena purificación de extractos, alta recuperación y bajo consumo de disolventes. SPE utiliza cromatografía de adsorción en fase normal sobre gel de sílice, cromatografía de partición en fase inversa sobre gel de sílice modificado químicamente con octadecilsilano, cromatografía de inmunoafinidad, así como cromatografía en columna sobre otros sorbentes (tierra de diatomita (celite), poliamida, polímeros obtenidos por impresión, etc. .
Las propiedades débilmente ácidas (pKA = 4,4) de la ocratoxina A (Fig. 1) determinan la necesidad de extraerla, ya sea en forma no disociada con mezclas de disolventes orgánicos con soluciones ácidas de agua y sal, o en forma de sal, con agua débilmente. Soluciones alcalinas, por ejemplo, solución de bicarbonato de sodio.
La HPLC de fase reversa (RP HPLC) con detección fluorimétrica es el método más utilizado para la determinación de ocratoxina A en alimentos.
El propósito del estudio fue desarrollar un método sensible para detectar, identificar y cuantificación ocratoxina A en los alimentos mediante la optimización de enfoques analíticos basados en SPE.
parte experimental
Equipos y reactivos. El sistema cromatográfico estuvo compuesto por una bomba de alta presión Jasco 880-PU, un inyector Rheodyne-7125 con un volumen de bucle dosificador de 20 μl, un detector fluorimétrico FL Detector modelo LC305 (Linear Instruments) (lex. = 250 nm, lam. = 458 nm) y un sistema de recogida y procesamiento de datos "Multichrome" (Ampersend). Columna cromatográfica (250 * 4,6 mm) con fase estacionaria Kromasil C18 (MetaChem Technologies Inc.), con un tamaño de partícula de 5 μm.
La extracción se llevó a cabo usando un aparato agitador shaker s-3.08L (ELMI); se usó una centrífuga TsLS 31M para centrifugar las muestras. La extracción en fase sólida se llevó a cabo utilizando un colector Macherey-Nagel, cartuchos de gel de sílice DIAPAK (BioKhimMak ST) y columnas de inmunoafinidad (IAC) OCHRAPREP (R-BIOFARM RHONE LTD). El pH de las soluciones se midió con un pHmetro MP 230 (Mettler Toledo). La concentración de la muestra se llevó a cabo utilizando un evaporador rotatorio Laborota 4000 (Heidolph). Para disolver los estándares y extractos evaporados se utilizó un baño de ultrasonidos UZV-12l (PKF SAPFIR). Para seleccionar las ondas óptimas de excitación y emisión, se utilizó un espectrofotómetro de fluorescencia Cary Eclipse (Varian). Una muestra estándar de ocratoxina A en una mezcla de benceno- ácido acético(99:1) con una concentración de C = 9,2 ng/μl.
Extracción en fase sólida:
Purificación mediante cromatografía en columna (CC) sobre tierra de diatomeas. La extracción de ocratoxina A de 25,0 g de muestra triturada se llevó a cabo con 125 ml de cloroformo después de añadir 20 ml de ácido acético al 2%. Agitar en un aparato agitador durante 30 minutos. Se aplicaron 50 ml de extracto cloroformo pasados a través de un filtro de papel a una columna de tierra de diatomeas impregnada con bicarbonato de sodio. La columna se lavó sucesivamente con 70 ml de hexano y 30 ml de cloroformo. La ocratoxina A se eluyó de la columna con 150 ml de una mezcla de benceno-ácido acético (86:12:2). El eluato se evaporó hasta sequedad, se disolvió en 3 ml de fase móvil (acetonitrilo - H3PO4 acuoso (pH = 2,6) (62:38) usando un baño ultrasónico.
Limpieza con CC sobre gel de sílice. La extracción de ocratoxina A de 20,0 g de muestra triturada se llevó a cabo con 100 ml de tolueno después de la adición secuencial de 30 ml de una solución de ácido clorhídrico 2 M y 50 ml de una solución de cloruro de magnesio 0,4 M. Se agitó durante 60 minutos, se centrifugó a 3500 rpm durante 5 minutos. La capa superior de tolueno se filtró a través de un filtro de papel, recogiéndose 50 ml del filtrado. Después de acondicionar con 10 ml de tolueno, se aplicaron 50 ml de filtrado al cartucho de gel de sílice, se lavó dos veces con 10 ml de n-hexano y 10 ml de una mezcla de tolueno-acetona (85:15), luego con 5 ml de tolueno. . La ocratoxina A se eluyó con 40 ml de una mezcla de tolueno – acetona – ácido acético (89:10:1). El eluato se evaporó hasta sequedad, se disolvió en 1 ml de fase móvil (acetonitrilo - H3PO4 acuoso (pH = 2,6) (62:38) usando un baño ultrasónico.
Purificación por inmunoafinidad CC. Extracción de ocratoxina A a partir de 50,0 g. La muestra triturada se trató con 200 ml de una mezcla de acetonitrilo y agua (60:40). Revuelva durante 30 minutos. Se mezclaron 4 ml del extracto pasados a través de un filtro de papel con 44 ml de fosfato y se aplicaron a una columna de inmunoafinidad (IAC), que luego se lavó con 20 ml de tampón fosfato. El tampón de fosfato restante se eliminó soplando aire en el IAC. La ocratoxina A se eluyó con 3 ml de una mezcla de metanol y ácido acético (98:2). El eluato se evaporó hasta sequedad, se disolvió en 1 ml de fase móvil (acetonitrilo - H3PO4 acuoso (pH = 2,6) (62:38) usando un baño ultrasónico.
Condiciones de HPLC. La identificación y determinación cuantitativa de la ocratoxina A se llevó a cabo mediante RP HPLC en modo de elución isocrática con detección fluorescente (lvoz.=250 nm, lam.=458 nm). Se utilizó como fase móvil una mezcla de acetonitrilo y H3PO4 acuoso (pH = 2,6) (62:38). La velocidad de elución fue de 1 ml/min. Se inyectaron 20 µl de la solución de prueba en el sistema de HPLC.
Resultados y discusión.
Al purificar el extracto por CC con tierra de diatomeas impregnada con bicarbonato de sodio, se utilizó como método base el método AOAC 975.38, que implica el uso de TLC para la identificación y determinación cuantitativa de ocratoxina A. Con el fin de aumentar la sensibilidad y especificidad de Para el método utilizamos RP HPLC con detección fluorescente. Como resultado de la aplicación del método básico, el grado de extracción de ocratoxina A de una matriz contaminada artificialmente con ocratoxina A a un nivel de 0,01 mg/kg en nuestras condiciones no superó el 40%. Para aumentar la tasa de extracción, realizamos una serie de cambios en las condiciones de extracción y purificación: se agregó ácido acético a la mezcla de extracción; el volumen de cloroformo utilizado para lavar la columna se redujo a 30 ml; se incluye acetona en la mezcla de elución; el volumen de la mezcla de elución se aumenta a 150 ml. Como resultado de la optimización del método, el valor de extracción de ocratoxina A del trigo aumentó al 60% (Tabla 1).
El grado de extracción aumentó significativamente utilizando el método de extracción en fase sólida en cartuchos con gel de sílice no modificado (un esquema cercano al método ICC No. 000). El ajuste del método básico (el contenido de tolueno en la mezcla de tolueno-acetona utilizada para lavar la columna se aumentó al 85%, se añadió acetona a la mezcla de elución, el volumen de la mezcla de elución se aumentó a 40 ml) hizo posible aumentar la tasa de recuperación al 80%.
Cuando se utilizó CH de inmunoafinidad, se observó el grado máximo de extracción de ocratoxina A de la matriz del alimento (hasta 100%), mientras que el límite de detección (0,0005 mg/kg) fue mayor que cuando se purificó CH en gel de sílice (0,00005 mg/kg). ).
Para detectar, identificar y cuantificar la ocratoxina A mediante HPLC, se seleccionó la composición óptima de la fase móvil (MP) y se refinaron las longitudes de onda de excitación y emisión de fluorescencia para garantizar la máxima señal y selectividad en la detección de la ocratoxina A (Tabla 2). Las longitudes de onda de excitación seleccionadas (250 nm en lugar de 333 nm) y emisión de fluorescencia para la fase móvil optimizada permitieron un aumento en la relación señal-ruido con una disminución correspondiente en el límite de detección del método. Cambiar la composición del PF hizo posible mejorar la separación de los picos de ocratoxina A y los componentes de la matriz del producto alimenticio y, al mismo tiempo, reducir el tiempo de retención del pico de ocratoxina A (Fig. 2).
La posibilidad de utilizar el método modificado que desarrollamos, basado en el uso de cartuchos de gel de sílice, en el análisis rutinario de ocratoxina A fue confirmada mediante un estudio selectivo de la frecuencia y el nivel de contaminación de los principales tipos de materias primas alimentarias con esta micotoxina. . Para ello, se estudiaron cereales alimentarios de la cosecha de 2004 de varias regiones de la Federación de Rusia (Cuadro 3). Nueve de las 46 muestras de granos analizadas contenían ocratoxina A en el rango de 0,00005 a 0,005 mg/kg, lo que no excedía las regulaciones adoptadas en los países de la UE.
Así, optimizando los enfoques analíticos existentes, se han propuesto dos variantes del método para la detección, identificación y cuantificación de ocratoxina A en productos alimenticios: uso de gel de sílice CC o CC de inmunoafinidad para la purificación de extractos y condiciones optimizadas de HPLC. El método basado en el uso de CC sobre gel de sílice tiene un límite de detección bajo y un coste reducido consumibles. La purificación mediante CC de inmunoafinidad proporciona una alta recuperación y pureza del extracto, y también tiene un límite de detección más alto (0,0005 mg/kg en lugar de 0,00005 mg/kg para la opción de purificación CC con gel de sílice). Los datos obtenidos como resultado de un estudio selectivo del contenido de ocratoxina A en las materias primas alimentarias indican la necesidad de realizar más estudios sobre la contaminación de los productos alimenticios con ocratoxina A para evaluar el riesgo de contaminación de los productos alimenticios con esta micotoxina para el salud de la población de la Federación de Rusia.
Instituto Estatal de Investigación en Nutrición de la Academia Rusa de Ciencias Médicas
109240, Moscú, Ustinsky proezd, 14/2
I. V. Aksenov, K. I. Eller, V. A. Tutelyan
Optimización de métodos analíticos para el análisis de ocratoxina A en alimentos.
La ocratoxina A es una micotoxina producida por especies de Aspergillus y Penicillium ampliamente distribuidas. La micotoxina es un contaminante común de los cereales, el café, el vino, los frutos secos y las especias. Se ha demostrado que la ocratoxina A es nefrotoxica, inmunosupresora, embriotóxica, teratogénica y cancerígena en muchas especies de mamíferos. El Codex Alimentarius y la CE han establecido un nivel máximo permisible de 5 mg/kg para la ocratoxina A en granos de cereales crudos y de 3 mg/kg para productos listos para el consumo derivados de cereales. Se han desarrollado dos modificaciones simples y confiables de métodos para el análisis de okratoxina A en alimentos que se basan en inmunoafinidad o limpieza de columnas de gel de sílice y HPLC con detección de fluorescencia. Los límites de detección fueron 0,5 mg/kg y 0,05 mg/kg respectivamente. Se han utilizado con éxito métodos para analizar la ocratoxina A en 46 muestras de cereales crudos cosechados en diferentes regiones de Rusia. Se encontró que nueve muestras estaban contaminadas con ocratoxina A en niveles que oscilaban entre 0,05 y 5 mg/kg.
Mejoramiento métodos analíticos Detección, identificación y cuantificación de ocratoxina A en productos alimenticios.
La ocratoxina A es una micotoxina producida por mohos muy extendidos de los géneros Aspergillius y Penicillium. Es un contaminante común de los productos cereales, el café, el vino, los frutos secos y las especias. Los efectos nefrotóxicos, inmunosupresores, embriotóxicos, teratogénicos y cancerígenos de la ocratoxina A han sido demostrados en muchas especies de mamíferos. Máximo establecido por el Codex Alimentarius y la UE nivel permitido el contenido de ocratoxina A en los cereales es de 5 μg/kg y en los productos de cereales listos para el consumo, de 3 μg/kg. Se han propuesto dos métodos optimizados para la detección, identificación y cuantificación de ocratoxina A en productos alimenticios: uso de gel de sílice CC o CC de inmunoafinidad para la purificación de extractos y HPLC con detección fluorescente. El límite de detección fue de 0,05 y 0,5 μg/kg, respectivamente. Los métodos desarrollados se utilizaron para analizar el contenido de ocratoxina A en 46 muestras de granos recolectadas en varias regiones de Rusia. Nueve muestras estaban contaminadas con ocratoxina A en niveles que oscilaban entre 0,05 y 5 μg/kg.
Pies de foto para dibujos.
Figura 1. Estructura química de la ocratoxina A.
Figura 2. Cromatogramas de una muestra de trigo contaminada con ocratoxina A a un nivel de 0,01 mg/kg, utilizando diferentes métodos de purificación:
A) CH sobre tierra de diatomeas B) CH sobre gel de sílice C) CH de inmunoafinidad.
Tabla 1. Características comparativas de varias maneras purificación de extractos.
Tabla 2. Características comparativas de los parámetros de HPLC (por 1 ng de ocratoxina A inyectado).
composición del LP | Longitudes de onda de detección fluorimétrica, nm | Tiempo de retención de seguridad Ah, min | Relación señal-ruido |
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acetonitrilo – agua – ácido acético (99:99:2) | |||||
acetonitrilo – agua – ácido acético (102:94:4) | |||||
Técnica optimizada | |||||
acetonitrilo – H3PO4 acuoso (pH=2,6) (124:76) |
Cuadro 3. Encuesta de muestra de los niveles de contaminación de ocratoxina A en cereales alimentarios de la cosecha de 2004.
Literatura
Recomendaciones metodológicas para la detección, identificación y determinación de ocratoxina A en productos alimenticios. - M., 1985. , Kravchenko (Aspectos médicos y biológicos) - M., 1985. AOAC, Determinación de ocratoxina A en vino y cerveza 2001.01 // J. AOAC Int. – 2001. - Vol. 84. - P. 1818. AOAC, Ocratoxina A en maíz y cebada 991.44 // J. AOAC Int. – 1996. - Vol. 79. – págs. 1102-1105. AOAC, Ocratoxina A en café verde 975.38 // J. AOAC Int. – 1975. - Vol. 58. - P. 258. Nota de aplicación para el análisis de ocratoxina A en cereales utilizando extractor de bicarbonato de sodio junto con Ochraprep. – Glasgow, 2001. Baggiani C., Giraudi G., Vanni A. // Bioseparación. - 2002. - Vol.10. – P. 389–Reglamento de misión (CE) nº 000/2002 // Diario Oficial de las Comunidades Europeas. - 2002. - L 75. - P. 18-20. Monografías de la IARC sobre la evaluación de riesgos cancerígenos para los seres humanos. vol. 56. – Lion, 1993. Jodlbauer J., Maier N. M., Lindner W. // Journal of Chromatography A. - 2002. - Vol. 945. – págs. 45–63. Jornet D., Busto O., Guasch J // Revista de Cromatografía A. - 2000. - Vol. 882. – págs. 29–35. Krogh P. // Nefropatía endémica, Actas del segundo Simposio internacional sobre nefropatía endémica, 9-12 de noviembre de 1972. - Sofía, 1972. – P. 266-277. Kuhn I., Valenta H., Rohr K. // Revista de cromatografía B. - 1995. - Vol. 668. – págs. 333–337. Majerus P., Weber R., Wolff J. // Bundesgesundheitsblatt. – 1994. – B. 37, N. 11. – S. 454 – 458. Monaci L., Palmisano F. // Anal. Bioanal. Química. - 2004. - Vol. 378. - págs. 96-103. Monaci L., Tantillo G., Palmisano F. // Anal. Bioanal. Química. - 2004. - Vol. 378. – pág. 1777–1782. Detección cuantitativa de ocratoxina A. - Glasgow, 2003. Informe de los expertos que participan en la Tarea 3.2.7 “Evaluación de la ingesta dietética de ocratoxina A por la población de los Estados miembros de la UE”. – Roma, 2002. Evaluación de la seguridad de determinadas micotoxinas en los alimentos. // Serie de Aditivos Alimentarios de la OMS, N° 47; Documento de alimentación y nutrición de la FAO 74. – Ginebra, 2001. Schwartz G. G. // Control de las causas del cáncer. - 2002. - Vol.13. - págs. 91-100. Scott P. M. // Adv. Exp. Medicina. Biol. - 2002. - Vol. 504. – págs. 117-134. Skaug MA, Helland I, Solvoll K, Saugstad O. D. // Food Addit. Contaminar. - 2001. - Vol. 18. – págs. 321-327. Visconti A., Pascale M., Centonze G. // Revista de cromatografía A. - 1999. - Vol. núm. 864. – págs. 89–101. Zimmerli B., Dick R. // Revista de cromatografía B. - 1995. - Vol. 666. – Pág. 85 – 99.
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CONSEJO INTERESTATAL DE NORMALIZACIÓN, METROLOGÍA Y CERTIFICACIÓN
CONSEJO INTERESTATAL DE NORMALIZACIÓN, METROLOGÍA Y CERTIFICACIÓN
INTERESTATAL
ESTÁNDAR
GRANOS Y SUS PRODUCTOS DE ELABORACIÓN, PIENSOS COMPUESTOS Determinación de ocratoxina A mediante cromatografía líquida de alta resolución.
(ISO 15141-1:1998, NEQ)
Publicación oficial
Informar estándar
Prefacio
Los objetivos, los principios básicos y el procedimiento básico para realizar trabajos de estandarización interestatal están establecidos en GOST 1.0-92 “Sistema de estandarización interestatal. Disposiciones básicas" y GOST 1.2 -2009 "Sistema de estandarización interestatal. Estándares, reglas y recomendaciones interestatales para la estandarización interestatal. Normas de desarrollo, adopción, aplicación, actualización y cancelación"
Información estándar
1 DESARROLLADO por la Sociedad de Responsabilidad Limitada “Lumex-Marketing” (Lumex-Marketing LLC)
2 INTRODUCIDO por la Agencia Federal de Regulación Técnica y Metrología (TK 335)
3 ADOPTADO por el Consejo Interestatal de Normalización, Metrología y Certificación (protocolo de 14 de noviembre de 2013 No. 44-2013)
4 Esta norma es consistente con las disposiciones fundamentales estándar internacional ISO 15141-1:1998 Productos alimenticios. Determinación de ocratoxina A en cereales y productos de cereales. Parte 1: Método de cromatografía líquida de alta resolución con gel de sílice (cromatografía líquida de limpieza con purificación en gel de sílice).
Nivel de conformidad - no equivalente (NEQ)
5 Por orden Agencia federal sobre regulación técnica y metrología del 30 de diciembre de 2013 N2 2429-st norma interestatal GOST 32587-2013 entró en vigor como norma nacional Federación Rusa desde el 1 de julio de 2015
6 PRESENTADO POR PRIMERA VEZ
7 REPUBLICACIÓN. marzo 2016
La información sobre los cambios a esta norma se publica en el índice de información anual “Normas Nacionales”, y el texto de los cambios y modificaciones se publica en el índice de información mensual “Normas Nacionales”. En caso de revisión (sustitución) o cancelación de esta norma, el aviso correspondiente se publicará en el índice de información mensual “Normas Nacionales”. La información, avisos y textos relevantes también se publican en sistema de información para uso general: en el sitio web oficial de la Agencia Federal de Regulación Técnica y Metrología en Internet.
© Standardinform, 2016
En la Federación de Rusia, esta norma no se puede reproducir, replicar ni distribuir total o parcialmente como publicación oficial sin el permiso de la Agencia Federal de Regulación Técnica y Metrología.
NOTA Los volúmenes de elución indicados deben modificarse de acuerdo con los valores obtenidos al determinar el coeficiente de transmisión de la ocratoxina A (ver 5.3.10).
5.4.4 Realización de mediciones cromatográficas
Registre al menos dos cromatogramas del concentrado de la muestra de prueba obtenido de acuerdo con 5.4.3, en las mismas condiciones en las que se calibró el sistema. La identificación de la ocratoxina A se lleva a cabo haciendo coincidir el tiempo de retención de la ocratoxina A en el extracto de muestra con su tiempo de retención obtenido al monitorear la estabilidad de la característica de calibración, estableciendo el ancho de la ventana de identificación en 5%.
En la Figura A.1 (Apéndice A) se muestra un ejemplo de cromatograma.
Si en el cromatograma del concentrado de muestra hay un pico identificado como el pico de ocratoxina A, se concluye sobre la presencia de ocratoxina A en la muestra, se determina su contenido para cada cromatograma registrado y la discrepancia entre los valores obtenidos. se verifica usando la fórmula (2).
Si se cumple la condición de la fórmula (2), entonces el valor medio aritmético de las concentraciones obtenidas se toma como resultado de medir la concentración másica de ocratoxina A en el concentrado de la muestra de prueba. Si no se cumple la condición de la fórmula (2), entonces se encuentran y eliminan las causas de la inestabilidad, después de lo cual se repite la inyección del concentrado de muestra.
Si es necesario confirmar la correcta identificación del pico de ocratoxina A, se recomienda agregar una solución de ocratoxina A en la fase móvil al concentrado de muestra. La confiabilidad de la identificación se puede juzgar por el aumento en la altura del pico esperado de ocratoxina A. La cantidad de solución de ocratoxina A agregada se determina basándose en el hecho de que la fracción de masa de ocratoxina A en la muestra debe aumentar en un 50%. 150% respecto al valor inicial.
Si la concentración másica de ocratoxina A en el concentrado final Cx excede los 100 ng/cm 3, se diluye con la fase móvil (ver 5.3.2.1). El factor de dilución Q se calcula mediante la fórmula
(8)
donde Vp es el volumen del concentrado diluido de la muestra de prueba, cm 3;
V a es el volumen de una alícuota del concentrado original de la muestra de prueba tomada para dilución,
5.5 Procesamiento de los resultados de las pruebas
La fracción de masa de ocratoxina A en la muestra X, ppm, se calcula mediante la fórmula
X= V 1- V 2" C X .P.10\ (9)
donde Vi es el volumen de cloroformo tomado para la extracción, cm 3 (30 cm 3);
V 2 - volumen del concentrado de muestra final, cm 3 (0,5 cm 3);
Cx es la concentración másica de ocratoxina A en el concentrado de muestra final (ver 5.4.4), ng/cm3; V 3 - volumen de extracto de cloroformo tomado para la prueba según 5.4.3, cm 3 (20 cm 3);
/l - masa de la muestra, g;
P es el coeficiente de paso de la ocratoxina A (véase 5.3.10);
Q es el factor de dilución del concentrado de muestra (ver 5.4.4);
5.6 Características metrológicas
El método proporciona resultados de medición con características metrológicas que no exceden los valores indicados en la Tabla 2.
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Tabla 2 |
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La discrepancia entre dos resultados de medición (X| y X 2, millones "1), obtenidos en un laboratorio en condiciones de repetibilidad, debe corresponder a la condición
\X 1 -X 2\<г, (10)
donde r es el límite de repetibilidad, millones" 1 (Tabla 2).
Cuando se cumple la condición (10), se toma como resultado de la medición la media aritmética de los resultados de medición obtenidos (Xj y X 2, millones "1).
La discrepancia entre dos resultados de medición obtenidos en dos laboratorios (Xi na 6 y X 2la b, millones "1) en muestras idénticas debe cumplir con la condición
donde R es el límite de reproducibilidad, millones" 1 (Tabla 2).
5.7 Control de calidad de los resultados de las mediciones.
El seguimiento de los indicadores de calidad de los resultados de las mediciones en el laboratorio implica el seguimiento de la estabilidad de los resultados de las mediciones, teniendo en cuenta los requisitos de GOST ISO 5725-6 (sección 6).
I 5.8 Registro de resultados de pruebas
Los resultados de la prueba se registran en un informe de prueba, que se redacta de acuerdo con los requisitos de GOST ISO/IEC 17025, y el informe de prueba debe contener una referencia a esta norma.
Los resultados de las mediciones del contenido de ocratoxina A (si se confirma que el procedimiento analítico cumple con los requisitos de esta norma en el laboratorio) se presentan en el formulario
X±D, millón" 1 o X±U, millón" 1, (12)
donde X es el resultado de la medición obtenido de acuerdo con 5,6, millones" 1;
A - límites de error absoluto en la medición del contenido de ocratoxina A (P = 0,95) según
cuadro 2, millones" 1;
U - incertidumbre ampliada en el factor de cobertura k = 2, millones" 1.
Los valores numéricos de los límites de error absoluto (incertidumbre) se expresan como un número que contiene no más de dos cifras significativas, y el dígito más pequeño del valor numérico del resultado final de la medición se considera igual al dígito más pequeño. del valor numérico de los límites del error absoluto (incertidumbre).
6 Método B
6.1 Esencia del método
El método se basa en la extracción de ocratoxina A con tolueno después de acidificar la muestra de prueba con ácido clorhídrico y agregar cloruro de magnesio para aumentar la fuerza iónica. El extracto se purifica mediante columnas de extracción en fase sólida llenas de gel de sílice y el contenido de ocratoxina A se determina mediante HPLC en fase inversa mediante detección fluorimétrica. Si es necesario, confirme la identificación de la ocratoxina A mediante derivatización con una solución de trifluoruro de boro en metanol.
6.2 Reactivos
Al realizar pruebas, utilice agua según 5.2.13, reactivos según 5.2.14 - 5.2.17, así como lo siguiente.
6.2.7 Disolvente mixto N° 1: tolueno (ver 6.2.3) y ácido acético glacial (ver 5.2.15) en una relación en volumen de 99:1.
6.2.8 Disolvente mixto N° 2: acetona (ver 6.2.5) y tolueno (ver 6.2.3) en una proporción en volumen de 5:95.
6.2.9 Disolvente mixto N° 3: tolueno (ver 6.2.3) y ácido acético glacial (ver 5.2.15) en una relación en volumen de 90:10.
6.2.10 Fase móvil
Mezclar 99 partes en volumen de acetonitrilo (ver 5.2.16) con 99 partes en volumen de agua (ver 5.2.13) y dos partes en volumen de ácido acético glacial (ver 5.2.15). Antes de su uso, se desgasifica la fase móvil.
6.2.11 Trifluoruro de boro, fracción másica de la sustancia principal no inferior a
6.2.12 Solución de trifluoruro de boro en metanol, p (BF 3) = 14 g/100 cm 3.
¡ATENCIÓN! Es necesario trabajar en una campana extractora que funcione bien. Debe evitarse el contacto con la piel, los ojos y los órganos respiratorios.
6.2.13 Ocratoxina A en forma cristalina o en forma de ampolla en forma de película con una fracción de masa de la sustancia principal de al menos el 95%
6.2.14 Ocratoxina A, solución madre
Disuelva 1 mg de ocratoxina A cristalina (ver 6.2.13) o el contenido de una ampolla de película que contenga ocratoxina A en un volumen tal de disolvente mixto No. 1 (ver 6.2.7) para obtener una solución con una concentración másica de ocratoxina A. de 20 a 30 μg/cm 3.
Para determinar la concentración másica exacta de ocratoxina A en la solución principal, registre su densidad óptica en el rango de longitud de onda de 300 a 370 nm con un paso de 5 nm en una cubeta de cuarzo con un espesor de capa óptica de 1 cm de acuerdo con 6.3.2 usando un espectrofotómetro (ver 6.3.1). Como solución de referencia se utiliza el disolvente mixto nº 1 según 6.2.7. La posición exacta del máximo de absorción se identifica registrando la densidad óptica cerca de él en incrementos de 1 nm. Calcular el valor de la concentración másica de ocratoxina A, C ref, μg/cm 3, según la fórmula
donde A max es la densidad óptica en el máximo de absorción (en este caso a 333 nm);
M es la masa molar de ocratoxina A, g/mol (M=403,8 g/mol);
100 - coeficiente de coordinación de unidades de longitud y masa; e - coeficiente de absorción molar de ocratoxina A en disolvente mixto N° 1, m 2 /mol, (e = 544 m 2 /mol);
/ es el espesor de la capa absorbente de la cubeta, cm.
6.2.15 Ocratoxina A, solución intermedia con una concentración másica de 1 μg/cm 3 Evaporar hasta sequedad en una corriente de nitrógeno una alícuota de la solución inicial (ver 6.2.14) que contiene 100 μg de ocratoxina A y disolver en 100 cm 3 de la fase móvil (ver 6.2.10). El volumen de la alícuota se calcula mediante la fórmula:
\/ a - volumen alícuota, cm 3;
100 - masa de ocratoxina A, µg;
Cie* es la concentración másica de la solución inicial de ocratoxina A según 6.2.14, μg/cm 3 .
La vida útil de la solución en el frigorífico a una temperatura de 2°C a 6°C y control periódico de su estabilidad no supera los 6 meses.
6.2.16 Soluciones de calibración de ocratoxina A
Colocar 1 en matraces aforados con capacidad de 100 cm 3; 2,5; 4 y 5 cm 3 de la solución intermedia de ocratoxina A (ver 6.2.15) y diluir hasta la marca con la fase móvil (ver 6.2.10). La concentración másica de ocratoxina A en las soluciones de calibración preparadas es 10; 25; 40 y 50 ng/cm 3 respectivamente, lo que corresponde a una masa de ocratoxina A de 0,2; 0,5; 0,8 y 1,0 ng en un volumen de dosificación de 20
6.3 Instrumentos de medida, equipos auxiliares, materiales y utensilios
Al realizar pruebas, se utilizan instrumentos de medición, equipos auxiliares, materiales y utensilios de acuerdo con 5.2.1 - 5.2.2, 5.2.6 - 5.2.11, 5.2.21 -5.2.34, así como lo siguiente.
6.3.1 Espectrofotómetro, adecuado para mediciones en el rango de longitud de onda de 300 a 370 nm y que tenga un ancho de banda espectral no superior a 2 nm.
6.3.2 Cubetas de cuarzo con una capa absorbente de 1 cm de espesor, que no absorben luz en el rango de longitud de onda de 300 a 370 nm.
6.3.3 Tubos de centrífuga, por ejemplo de 250 cm 3 de capacidad, fabricados en polietileno de alta densidad con tapón de rosca.
6.3.4 Centrífuga refrigerada, preferentemente refrigerada, para tubos de centrífuga (ver 6.3.3), capaz de generar una aceleración de al menos 3 500 g.
NOTA La velocidad de rotación de la centrífuga que proporciona la aceleración especificada se selecciona de acuerdo con las recomendaciones del fabricante de la centrífuga.
6.3.5 Columna de extracción en fase sólida desechable llena de gel de sílice.
Después de abrir el paquete, la columna se acondiciona durante dos horas a 105 °C y se almacena sobre gel de sílice activado con un indicador de humedad. Antes de su uso, se pasan 10 cm 3 de tolueno a través de la columna (ver 6.2.3). Con cada nuevo lote de columnas se comprueba el rendimiento de ocratoxina A. Por ejemplo, son adecuadas las columnas fabricadas con tubo de polipropileno con una capacidad de 3 cm 3 con las siguientes características:
El peso medio del gel de sílice es de 690 mg;
Tamaño de poro: 12,5 nm;
El tamaño de las partículas es de 55 a 105 micrones.
6.3.6 Depósitos para disolventes, como jeringas, por ejemplo de 50 ml de capacidad, con abertura central y tapón.
6.3.7 Embudo de decantación con una capacidad de 50 cm 3 según GOST 25336.
6.3.8 Filtros de membrana para soluciones acuosas, fabricados en politetrafluoroetileno, con un tamaño de poro de 0,45 micras.
6.3.9 Viales con tapón de rosca o engarzado.
6.3.10 Microespíritus con capacidad de 500 mm 3.
6.3.11 Equipos de cromatografía líquida de alta resolución
6.3.11.1 Cromatografía líquida según 5.2.1.
Longitud................................................. ..250 milímetros;
Diámetro interior................................4 mm;
Tamaño de partícula esférica........................5 micras.
6.3.11.2 Columna cromatográfica analítica, llena de un sorbente de fase inversa con un tamaño de grano de 5 µm, que garantiza la separación del pico de ocratoxina A y otros picos hasta la línea base 1 con las siguientes características:
Nota: está permitido utilizar columnas analíticas de otros tamaños (por ejemplo, de 120 a 150 mm de largo).
6.3.11.3 Precolumna del mismo diámetro interno y rellena con la misma dirección de frente
sorbente de fase, de la misma longitud que la columna analítica
6.3.11.4 Precolumna del mismo diámetro interno y llena del mismo sorbente de fase inversa que la columna analítica, por ejemplo, con las siguientes características:
Longitud................................................. ...40 milímetros;
Diámetro interior................................4 mm;
Tamaño de partícula esférica........................5 micras.
Nota - Se permite el uso de precolumnas de otros tamaños estándar.
Se permite el uso de otros instrumentos de medida con características metrológicas y equipos auxiliares con características técnicas no peores, así como materiales y reactivos de no inferior calidad a los anteriores.
6.4 Rendimiento de la prueba
6.4.1 Generalidades
Las pruebas deben completarse dentro de un día hábil.
6.4.2 Extracción de ocratoxina A de la muestra
Coloque (20,0 ± 0,1) g de la muestra preparada para la prueba de acuerdo con la cláusula 3 en un tubo de centrífuga (ver 6.3.3). Si el contenido de ocratoxina esperado es superior a 0,005 ppm, el peso de la muestra se reduce a 10 g; de lo contrario, se debe tener en cuenta el posible riesgo de una reducción de la recuperación de ocratoxina A de la muestra;
Agregue secuencialmente 30 cm 3 de solución de ácido clorhídrico (ver 6.2.1), 50 cm 3 de solución de cloruro de magnesio (ver 6.2.2), revuelva con una varilla de vidrio y agregue 100 cm 3 de tolueno.
Agitar durante 60 minutos y luego centrifugar la suspensión. El tiempo de centrifugación depende de la eficiencia de la centrífuga. La centrifugación se lleva a cabo mientras se enfría para evitar la pérdida de tolueno. Tome una alícuota de 50 cm 3 de la capa superior (tolueno) (y 2) y pásela a través de una columna de extracción en fase sólida preparada de acuerdo con 6.3.5 con un depósito conectado a ella (ver 6.3.6).
Nota: se debe tener cuidado para evitar sobrecargar la columna.
La columna se lava con dos porciones de 10 cm 3 de hexano (ver 5.2.17) y luego con dos porciones de disolvente mixto No. 2 (ver 6.2.8). Luego lavar con 5 cm 3 de tolueno, desechando todos los eluatos.
Eluir la ocratoxina A con dos porciones de 15 cm 3 de disolvente mixto N° 3 (ver 6.2.9) en un matraz de fondo puntiagudo de 50 cm 3 (ver 5.2.25). El eluato combinado se evapora cuidadosamente hasta obtener un residuo seco bajo presión reducida y una temperatura que no exceda los 40°C. El residuo se disuelve en 1 cm 3 (\/ 3) de la fase móvil (ver 6.2.10) y se transfiere a un vial (ver 6.3.9).
Notas
1 Las condiciones para la elución de la ocratoxina A y las operaciones posteriores pueden depender del tipo de columna de extracción en fase sólida utilizada. Por ejemplo, debería comprobar si el volumen de eluyente especificado anteriormente es apropiado para el tipo de columna utilizada.
2 El tamaño y/o la forma del matraz pueden tener un efecto negativo en el rendimiento de ocratoxina A.
6.4.3 Condiciones para el análisis cromatográfico
La lisis se lleva a cabo en las siguientes condiciones:
Caudal de la fase móvil....1 cm 3 /min;
Longitud de onda de excitación de fluorescencia....330 nm;
Longitud de onda de registro de fluorescencia...460 nm;
Volumen de dosificación...................................20 mm 3.
6.4.4 Calibración del cromatógrafo
Si se utiliza una columna según 6.3.11.2 y una fase móvil según 6.2.10, el análisis cromatográfico
El cromatógrafo se calibra al dominar la técnica y en el futuro en todos los casos en que cambien las condiciones de análisis cromatográfico.
Se introducen en el cromatógrafo al menos cuatro soluciones de calibración con diferentes concentraciones másicas de ocratoxina A (ver 6.2.16). El volumen de dosificación de cada solución de calibración debe ser el mismo.
La característica de calibración se establece como la dependencia del área o altura del pico de la masa de ocratoxina A en el volumen inyectado.
Verifique la linealidad de la característica de calibración establecida utilizando el coeficiente de correlación (ver 5.3.7). Todos los días antes de comenzar a trabajar, verificar la estabilidad de la característica de calibración de la misma manera que en 5.3.8, utilizando una solución de calibración de ocratoxina A con una concentración másica de 25 ng/cm 3 (ver 6.2.16).
6.4.5 Identificación de la ocratoxina A
El pico de ocratoxina A se identifica comparando los tiempos de retención de los picos en el cromatograma de la muestra y las soluciones de calibración. En algunos casos, puede ser necesario introducir la muestra con la adición de una solución de ocratoxina A en la fase móvil (ver 5.4.4).
6.4.6 Cuantificación
La solución de muestra preparada según 6.4.2 se introduce inmediatamente en el cromatógrafo. El volumen de dosificación debe ser igual al volumen de dosificación de las soluciones de calibración al calibrar el cromatógrafo (ver 6.4.4).
Mida el área o la altura del pico de ocratoxina A en el cromatograma de la muestra y, utilizando la característica de calibración (ver 6.4.4), encuentre su masa (/n-i, ng) en el volumen inyectado.
Si el valor de respuesta de ocratoxina A en el cromatograma de muestra está fuera de la característica de calibración, entonces la solución de muestra preparada se diluye o concentra antes de ingresar al cromatograma, teniendo en cuenta este hecho al calcular los resultados de la medición de acuerdo con 6.5.
6.4.7 Confirmación
Si es necesario, confirmar la identificación del pico de ocratoxina A mediante su desaparición y la aparición simultánea de un pico con un tiempo de retención coincidente con el tiempo de retención del pico de éster metílico de ocratoxina A como resultado de la derivatización con estrifluoruro de boro.
Tomar 0,5 cm 3 de la solución preparada según 6.4.2 en un matraz de fondo puntiagudo y evaporar hasta sequedad en un rotavapor (ver 5.2.7). El residuo seco se disuelve en 1 cm 3 de cloruro de metileno (ver 6.2.4) y se añaden 2 cm 3 de una solución de trifluoruro de boro en metanol (ver 6.2.12).
El matraz se tapa herméticamente y se calienta en un baño de agua a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 15 minutos. Después de enfriar, la solución se transfiere a un embudo de decantación de 50 cm 3 de capacidad que contiene 30 cm 3 de agua, se agita 30 veces con tres porciones de cloruro de metileno de 10 cm 3 cada una. Combinar las fases orgánicas después de cada extracción en otro embudo de decantación de 50 cm 3 de capacidad, añadir 20 cm 3 de agua para lavado y agitar durante 30 s.
Filtrar la fase orgánica a través de una capa de sulfato de sodio anhidro (ver 5.2.14) en un matraz de fondo afilado, evaporar hasta sequedad, disolver en 500 mm 3 de la fase móvil (ver 6.2.10) y registrar el cromatograma del resultado. solución en las condiciones del apartado 6.4.3.
Para encontrar el tiempo de retención del éster metílico de ocratoxina A y verificar que la derivatización esté completa en las condiciones anteriores, trate la solución intermedia de acuerdo con 6.2.15.
6.5 Procesamiento de los resultados de las pruebas
La fracción de masa de ocratoxina A X, millones" 1 se calcula mediante la fórmula
donde Vi es el volumen de tolueno tomado para extracción según 6.4.2, cm 3 (100 cm 3);
\/ 3 - volumen de solución de muestra preparada según 6.4.2, cm 3 (1 cm 3);
mi es la masa de ocratoxina A, determinada según 6.4.6, ng;
V 2 - volumen de la alícuota centrifugada según 6.4.2, cm 3 (50 cm 3);
V 4 - volumen de dosificación de la solución de muestra preparada, cm 3;
/77 - masa de muestra tomada para la prueba, g;
10" 3 - coeficiente de coordinación de las dimensiones de las unidades de masa.
6.6 Características metrológicas
6.6.1 Los resultados de las pruebas entre laboratorios para determinar la precisión del método, realizadas de acuerdo con GOST ISO 5725-2, se dan en el Apéndice B. Los valores obtenidos como resultado de las pruebas entre laboratorios pueden no ser aplicables. en los rangos de contenidos de ocratoxina A y para matrices diferentes a las especificadas en el Apéndice B.
6.6.2 La discrepancia absoluta entre dos resultados de pruebas individuales obtenidos en condiciones de repetibilidad puede exceder el límite de repetibilidad r en no más del 5% de los casos.
Valores límite de repetibilidad g para el análisis de harina integral de trigo:
/=0,18 µg/kg (0,00018 millones" 1) en X=0,41 µg/kg (0,00041 millones" 1);
/=0,70 μg/kg (0,00070 millones" 1) en X = 1,23 μg/kg (0,00123 millones" 1).
6.6.3 La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas individuales obtenidos en condiciones de reproducibilidad puede exceder el límite de reproducibilidad R en no más del 5% de los casos.
Valores de los límites de reproducibilidad R al analizar harina de trigo integral: R=0,30 µg/kg (0,00030 millones" 1) a X=0,41 µg/kg (0,00041 millones" 1);
R=1,10 µg/kg (0,00110 millones" 1) en X = 1,23 µg/kg (0,00123 millones" 1).
6.7 Control de calidad de los resultados de las mediciones - según 5.7.
6.8 Registro de los resultados de las pruebas - según 5.8.
Apéndice A (referencia)
Cromatograma de ejemplo
A.1 La Figura A.1 muestra un cromatograma de ejemplo (Método A) de concentrado de muestra estándar OW-815 Ocratoxina A en trigo molido, fabricado por R-Biopharm Rhone Ltd. con una fracción de masa de ocratoxina A (0,0049 + 0,0010) millones" 1.
4 6 8 10 12 14 16 Tiempo, minutos
Figura A.1 - Ejemplo de cromatograma 2 3
Apéndice B (para referencia)
Datos de precisión
B.1 Los datos presentados en la Tabla B.1 se obtuvieron como resultado de pruebas entre laboratorios realizadas para el método B de acuerdo con GOST ISO 5725-2 por el Instituto Max von Pettenkofer (Berlín, Alemania) en muestras de harina de trigo.
Tabla B.1 - Datos sobre la precisión del método
Nombre
harina de trigo
harina de trigo
indicador
Número de laboratorios
Número de muestras
Número de laboratorios que quedan después de eliminar los valores atípicos
Número de emisiones
Número de resultados aceptados
Valor medio X, µg/kg
Desviación estándar de repetibilidad s r , µg/kg
Desviación estándar relativa de la repetibilidad RSD r
Límite de repetibilidad g, µg/kg
Desviación estándar de reproducibilidad s R , µg/kg
Reproducibilidad desviación estándar relativa RSD r
Límite de reproducibilidad R, µg/kg
UDC 543.544.5.068.7:006.354 MKS 67.060 NEQ
Palabras clave: cereales, cereales alimentarios, cereales forrajeros, piensos compuestos, productos de procesamiento de cereales, métodos de prueba, cromatografía, cromatografía líquida de alta resolución, ocratoxina A, micotoxinas.
Firmado para su publicación el 14 de abril de 2016. Formato 60x84V 8 .
uel. horno l. 2.33. Tirada 22 ejemplares. Zach. 1070.
Elaborado en base a la versión electrónica proporcionada por el desarrollador del estándar.
FSUE "ESTÁNDARINFORME"
123995 Moscú, Granatny per., 4. www.gostinfo.ru [correo electrónico protegido]
GRANO ESTÁNDAR Y SUS PRODUCTOS DE ELABORACIÓN, PIENSOS COMPUESTOS Determinación de ocratoxina A mediante cromatografía líquida de alta resolución
INTERESTATAL
Granos y productos de su elaboración, piensos mixtos.
Determinación de ocratoxina A mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Fecha de introducción - 2015-07-01
1 área de aplicación
Esta norma se aplica al grano y sus productos procesados y establece métodos para determinar el contenido de ocratoxina A mediante cromatografía líquida de alta resolución (en adelante HPLC) con detección fluorimétrica utilizando:
Cribado de muestras y purificación por cromatografía en columna (método A) en cereales alimentarios, harinas y productos cerealeros a base de trigo, maíz, cebada, centeno, avena y arroz, piensos y materias primas para su producción a base de cereales (tortas, harinas). en el rango de medición, fracción de masa de ocratoxina A de 0,0025 a 1,0 millones" 1;
Purificación por extracción en fase sólida (método B) en granos de cereales y harina en el rango de medición de la fracción de masa de ocratoxina A superior a 0,0004 millones" 1.
Nota -1 millón" 1 corresponde a 1 mg/kg o 1000 µg/kg.
2 referencias normativas
Esta norma utiliza referencias normativas a las siguientes normas:
De la muestra combinada se aísla una muestra de laboratorio que pesa al menos 100 g, que se muele hasta tal punto que pasa a través de un tamiz con un diámetro de orificio de 1 mm. La muestra de laboratorio molida aislada se mezcla completamente y se almacena hasta el momento de la prueba en un lugar seco y oscuro en un recipiente tapado.
Las muestras de harina se prueban sin molerlas.
4 Requisitos de seguridad
Al realizar mediciones, se deben observar los siguientes requisitos:
Seguridad eléctrica de acuerdo con GOST 12.1.019 y documentación técnica del cromatógrafo;
Seguridad contra explosiones de acuerdo con GOST 12.1.010;
Seguridad contra incendios según GOST 12.1.004;
Seguridad al trabajar con sustancias peligrosas de acuerdo con GOST 12.1.007.
ADVERTENCIA: La ocratoxina A causa daño renal y hepático y se sospecha que es carcinógena. Todo el trabajo relacionado con la preparación de muestras y la preparación de soluciones de ocratoxina A debe realizarse en una campana extractora utilizando ropa protectora, guantes y gafas de seguridad. La descontaminación del material de vidrio que ha estado en contacto con ocratoxina A se realiza con una solución de hipoclorito de sodio al 4%.
5 Método A
5.1 Esencia del método
El método se basa en la extracción de ocratoxina A de la muestra del producto analizado con cloroformo acidificado, el cribado de muestras que puedan contener ocratoxina A, la purificación de sus extractos mediante cromatografía en columna de gel de sílice y la determinación de la fracción másica de ocratoxina A mediante HPLC con fluorimétrico. detección.
5.2 Instrumentos de medida, equipos auxiliares, materiales de referencia, reactivos, cristalería y materiales
5.2.1 Cromatógrafo líquido con detector fluorimétrico o espectrofluorimétrico que proporciona excitación de fluorescencia en la región espectral (330 + 20) nm y registro.
estratificación de la intensidad de fluorescencia en la región espectral (465 ± 20) nm. El detector utilizado debe proporcionar un límite de detección de ocratoxina A no superior a 5 ng/cm 4 5
5.2.2 Balanzas no automáticas de acuerdo con GOST OIML R 76-1-2011 con límites de error absoluto permitidos de no más de ± 0,01 g.
5.2.3 Columna cromatográfica analítica, llena de un sorbente de fase inversa con un tamaño de grano de 5 μm, que tenga una eficiencia de al menos 5000 platos teóricos para el pico de ocratoxina A*.
5.2.4 Precolumna del mismo diámetro interno y llena con el mismo sorbente de fase inversa que la columna analítica.
5.2.5 Columna cromatográfica de vidrio con tapón esmerilado, de 200 mm de largo y diámetro interno de 10 mm.
5.2.6 Molinillo de muestras capaz de triturar partículas menores a 1 mm, como un molino de laboratorio.
5.2.7 Rotaevaporador tipo IR-1 M2 o similar, equipado con baño maría con controlador de temperatura en el rango de 20 °C a 50 °C.
5.2.8 Un dispositivo para mezclar muestras (agitador), que proporciona una frecuencia de agitación de hasta 120 min" 1.
5.2.9 Bomba de vacío de laboratorio, de membrana o de chorro de agua según GOST 25336, que proporciona un vacío de 2,5 a 10 kPa.
5.2.10 Armario de secado que proporcione temperaturas de hasta 200 °C.
5.2.12 Muestra estándar de la composición de una solución de ocratoxina A en acetonitrilo con una concentración másica de 50 μg/cm 5 con un error permisible de ± 2,5 μg/cm 5. Permitido usar
muestras estándar de la composición de una solución de ocratoxina A en otros disolventes, que deben tenerse en cuenta al preparar la solución inicial de acuerdo con 5.3.3.1.
5.2.13 Agua destilada según GOST 6709 o agua para análisis de laboratorio, nivel de pureza 1 según GOST ISO 3696.
5.2.22 Pipetas graduadas tipos 1-3 diseños 1(1 a) o 2(2a) 2.a clase de precisión con una capacidad de 1,2, 5 cm 5 según GOST 29227.
5.2.23 Cilindros dimensionales de las versiones 1-4 de la segunda clase de precisión con una capacidad de 25, 50, 250 cm 5 según GOST 1770.
5.2.24 Matraces aforados 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 según GOST 1770.
5.2.25 Matraces de fondo puntiagudo 0-10-14/23 y 0-50-14/23 según GOST 25336.
5.2.26 Matraces de fondo plano tipo P-1 o Kn-1 con una capacidad de 50, 100, 250 cm 5 según GOST 25336.
5.2.27 Dispensadores de pipetas monocanal de volumen variable de 100 a 1000 mm 5 con características metrológicas de acuerdo con GOST 28311.
5.2.28 Embudos de laboratorio tipo B según GOST 25336.
5.2.30 Tubo de micromuestra de un solo uso (tipo Eppendorf) con capacidad
5.2.31 Recipientes de vidrio con capacidad de 50, 250, 1000 cm 5 con tapones de vidrio esmerilado, fluoroplástico o polietileno.
5.2.32 Tamiz con un diámetro de orificio de 1,0 mm.
5.2.33 Varillas de vidrio.
5.2.34 Reloj de arena o cronómetro.
5.2.35 Filtros de papel “cinta roja”.
5.2.37 Gel de sílice para cromatografía en columna con tamaño de partícula de 100 a 200 micras. Se permite el uso de otros instrumentos de medida con características metrológicas no
peores que los anteriores y equipos y materiales auxiliares con características técnicas no peores que los anteriores.
5.3 Preparación para las pruebas
5.3.1 Preparación de cristalería
Los platos para preparar y almacenar la fase móvil se lavan únicamente con ácido sulfúrico de acuerdo con 5.2.20 (sin el uso de otros detergentes), se lavan a fondo con agua del grifo y se enjuagan con agua destilada.
El resto de la cristalería se lava con agua caliente y detergente, se enjuaga abundantemente con agua destilada y se seca en estufa a una temperatura de 105°C.
5.3.2 Preparación de soluciones auxiliares.
5.3.2.1 Preparación de la fase móvil
Colocar 5 cm 3 de ácido acético glacial (ver 5.2.15), 215 cm 3 de acetonitrilo (ver 5.2.16) en un matraz aforado de 500 cm 3 de capacidad con tapón de vidrio esmerilado, fluoroplástico o polietileno bien cerrado y diluir. hasta la marca con agua destilada. La mezcla está bien mezclada. El contacto de la fase móvil con el caucho es inaceptable.
La vida útil de la mezcla a temperatura ambiente no es más de 1 mes.
5.3.2.2 Preparación de una solución de ácido acético con una fracción en volumen del 1%.
Coloque 200 cm 3 de agua destilada y 2 cm 3 de ácido acético glacial (ver 5.2.15) en un matraz de fondo plano con una capacidad de 250 cm 3 y mezcle bien.
La vida útil de la solución a temperatura ambiente en un recipiente de vidrio con un tapón de vidrio esmerilado, fluoroplástico o polietileno bien cerrado no es más de 1 mes.
5.3.2.3 Preparación de una mezcla de cloroformo y ácido fórmico en una proporción volumétrica
Coloque 200 cm 3 de cloroformo (ver 5.2.18) y 4 cm 3 de ácido fórmico (ver 5.2.19) en un matraz de fondo plano con una capacidad de 250 cm 3. Añadir 10 g de sulfato de sodio anhidro (5.2.14). La mezcla se mezcla bien y se filtra a través de un filtro de cinta roja.
La vida útil de la mezcla a temperatura ambiente en un recipiente de vidrio con tapón de vidrio esmerilado, fluoroplástico o polietileno no es superior a 1 mes.
5.3.3 Preparación de soluciones de ocratoxina A
5.3.3.1 Preparación de una solución madre de ocratoxina A con una concentración másica de 1
Con una pipeta, tomar 1 cm 3 de una muestra estándar de la composición de una solución de ocratoxina A en acetonitrilo con una concentración másica de 50 μg/cm 3 (ver 5.2.12), colocarla en un matraz aforado con capacidad de 50 cm 3 y ajustar el volumen hasta la marca con acetonitrilo (ver 5.2.16).
La vida útil de la solución preparada en el frigorífico a una temperatura de 2°C a 6°C no es más de 6 meses.
Cuando se utiliza una muestra estándar de la composición de una solución de ocratoxina A en otros disolventes, se evapora una alícuota (1 cm3) hasta obtener un residuo seco al vacío a una temperatura de baño de agua de 40 °C a 45 °C o en una corriente. de nitrógeno. El residuo seco se disuelve en 2 cm 3 de acetonitrilo y se agita durante 1 minuto. Luego, la solución resultante se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 50 cm 3 y se diluye hasta la marca con acetonitrilo.
Nota - Se permite preparar una solución madre de ocratoxina A según 6.2.14 -6.2.15 utilizando acetonitrilo en lugar de la fase móvil según 6.2.10.
5.3.3.2 Preparación de una solución de ocratoxina A en acetonitrilo con una concentración másica de 100
Colocar 5 cm 3 de solución de ocratoxina A con una concentración másica de 1 μg/cm 3 según 5.3.3.1 en un matraz aforado con una capacidad de 50 cm 3 , lo que corresponde a 1000 ng/cm 3 , y ajustar el volumen a la marcar con la fase móvil según 5.3.2.1.
La vida útil de la solución resultante en el frigorífico a una temperatura de 2°C a 6°C no supera los 3 meses.
5.3.3.3 Preparación de soluciones de calibración de ocratoxina A
La solución inicial de ocratoxina A en acetonitrilo según 5.3.3.1 se coloca en un matraz aforado con una capacidad de 50 cm 3. El volumen de solución de ocratoxina A debe cumplir con los requisitos de la Tabla 1.
Tabla 1
solución
Volumen de la solución inicial según 5.3.3.1, cm 3
Valor nominal de concentración de masa, ng/cm 3
El contenido del matraz se diluye hasta la marca con la fase móvil según 5.3.2.1 de acuerdo con la Tabla 1.
La vida útil de las soluciones de calibración no supera los siete días.
Nota - Si es necesario, se permite preparar soluciones de ocratoxina A de otras concentraciones de la misma manera dentro del rango de linealidad de la característica de calibración (ver 5.3.7).
5.3.3.4 Todas las soluciones de ocratoxina A se almacenan en un refrigerador a una temperatura que no exceda los 6 °C o en un congelador a una temperatura que no exceda los -18 °C en recipientes de vidrio o fluoroplástico.
El valor real de la concentración másica de ocratoxina A en soluciones de acuerdo con 5.3.3.1 - 5.3.3.3 se calcula en función de los valores de la concentración másica de ocratoxina A según el pasaporte de muestra estándar.
Antes de su uso, las soluciones se conservan hasta que alcancen la temperatura ambiente.
5.3.4 Preparación de la columna de cromatografía de vidrio.
Se prepara una columna de cromatografía de vidrio inmediatamente antes del ensayo.
Coloque (1,0 ± 0,1) g de gel de sílice (ver 5.2.37) en un vaso con una capacidad de 50 cm3, agregue de 10 a 15 cm3 de cloroformo (ver 5.2.18) y mezcle bien. La suspensión resultante se mantiene en un vaso durante 4-5 minutos y luego la suspensión de gel de sílice se transfiere a la columna en varios pasos a través de un embudo con un diámetro de 25 o 36 mm, habiendo colocado previamente un trozo de algodón en su fondo. .
Después de que el gel de sílice se haya asentado en la columna, se vierte encima una capa de aproximadamente 2 g de sulfato de sodio anhidro (ver 5.2.14).
Mientras se trabaja con la columna, no se debe permitir que el sorbente se seque; para ello, es necesario mantener una capa de disolvente sobre el agente secante. Cuando esté lista, la columna debe llenarse con cloroformo por encima del nivel de sorbente, cerrarse con un tapón de vidrio esmerilado y la salida de la columna debe sumergirse en cloroformo.
La columna preparada se utiliza una vez.
5.3.5 Preparación del cromatógrafo
El cromatógrafo está preparado para realizar mediciones de acuerdo con el manual de funcionamiento (instrucciones).
Establezca las longitudes de onda de trabajo para la excitación y el registro de fluorescencia (ver 5.2.1). La velocidad de alimentación de la fase móvil se establece en función del tamaño de la columna, siguiendo las instrucciones del cromatógrafo y del fabricante de la columna. Por ejemplo, para la columna especificada en 5.2.3, el caudal de fase móvil recomendado es 200 mm 3 /min. Si hay termostato de columna, ajuste la temperatura a (25 ± 1) °C.
5.3.6 Condiciones para el análisis cromatográfico
Si se utiliza una columna cromatográfica según 5.2.3 y una fase móvil según 6.2.10, el análisis cromatográfico se realizará en las siguientes condiciones:
Longitud de onda de excitación de fluorescencia...................330 nm;
Longitud de onda de registro de fluorescencia...................465 nm;
Caudal de la fase móvil...................200 mm 3 /min;
Volumen de dosificación................................................ ... 20 mm 3;
Temperatura del termostato de columna (si está equipado)...(25 ± 1) °C.
Cuando se utilizan columnas de otros tamaños, el caudal de la fase móvil y el volumen de dosificación se seleccionan de acuerdo con las instrucciones del cromatógrafo y del fabricante de la columna.
5.3.7 Calibración del cromatógrafo
El rango de linealidad de la característica de calibración es de 10 a 100 ng/cm 3 . Las soluciones de calibración de ocratoxina A según 5.3.3.3 se utilizan como muestras para la calibración del cromatógrafo.
Se registran al menos dos cromatogramas de cada solución de calibración y se calibra el cromatógrafo, estableciendo los parámetros de la característica de calibración y el tiempo de retención de la ocratoxina A mediante el software del cromatógrafo.
Calcule el coeficiente de correlación y las desviaciones de los valores calculados de la concentración másica de ocratoxina A en cada punto de calibración del valor real de acuerdo con el procedimiento para preparar soluciones de calibración (ver 5.3.3.3).
La graduación se considera aceptable si:
Coeficiente de correlación no inferior a 0,998;
La desviación relativa del valor calculado de la concentración másica de ocratoxina A del valor real no supera el + 10%. En lugar de la desviación relativa, la aceptabilidad de la característica de calibración se puede evaluar mediante la desviación estándar relativa, que no debe exceder el 5%.
5.3.8 Monitoreo de la estabilidad de la característica de calibración
La estabilidad de la característica de calibración se controla diariamente antes de comenzar.
Como solución de control, utilice una solución de ocratoxina A en la fase móvil, preparada de manera similar a 5.3.3.3. La concentración másica de ocratoxina A en la muestra de control se selecciona en función del contenido esperado de ocratoxina A en las muestras de prueba; Se recomienda utilizar una solución de ocratoxina A con una concentración másica de 20 ng/cm.
Se registran al menos dos cromatogramas de la solución de control y se identifica el pico de ocratoxina A mediante el tiempo de retención con un ancho de ventana de identificación del 5%, introduciendo, si es necesario, una corrección por software del tiempo de retención del pico y utilizando la característica de calibración. , se calcula la concentración másica de ocratoxina A para cada entrada.
La convergencia de los valores del tiempo de retención y los valores de concentración másica de ocratoxina A se comprueba mediante las fórmulas:
donde U y t 2 son el tiempo de retención del pico de ocratoxina A en el primer y segundo cromatograma, respectivamente, min;
I - valor medio aritmético de U y t 2, mín.
Sk: y C «2 - concentraciones másicas de ocratoxina A en la solución de control según el primer y segundo cromatograma, respectivamente, ng/cm 3 ;
C k - media aritmética de los valores de C K: y C yu, ng/cm 3.
La dependencia de la calibración se considera estable si se cumple la condición.
donde C es la concentración másica de ocratoxina A en la solución de control, ng/cm.
Si no se cumple la condición (3), se repite el procedimiento de control. Los resultados del control repetido se consideran definitivos y se vuelve a realizar la calibración del cromatógrafo según 5.3.7.
Nota: normalmente se requiere una calibración repetida del cromatógrafo cuando cambia la eficiencia del sistema cromatográfico o la sensibilidad del detector (por ejemplo, después de reparaciones o un tiempo de inactividad prolongado del cromatógrafo).
5.3.9 Control de la muestra en blanco reactivo
El análisis de una muestra reactiva en blanco se lleva a cabo antes del análisis de las muestras de prueba.
Coloque 30 cm 3 de cloroformo y 2,5 cm 3 de solución de ácido acético según 5.3.2.2 en un matraz de fondo plano con una capacidad de 50 cm 3, mezcle bien y retire con cuidado 20 cm 3 de cloroformo de la capa inferior en un recipiente afilado. -matraz de evaporación de fondo con una capacidad de 50 cm 3, sin permitir que entre agua.
El matraz de fondo afilado se coloca en un evaporador rotatorio y se evapora al vacío hasta obtener un residuo seco a una temperatura de baño de agua de 40 °C a 45 °C. Continúe realizando todas las operaciones de acuerdo con 5.4.3, obteniendo así una muestra concentrada en blanco. Realizar un estudio cromatográfico del concentrado resultante según 5.4.4. Si el cromatograma contiene picos que tienen un tiempo de retención cercano al pico de ocratoxina A, entonces se encuentran y eliminan las causas de la contaminación de la muestra en blanco (reactivos o material de vidrio).
Nota: La razón más común para un resultado de control en blanco insatisfactorio es la pureza insuficiente del cloroformo, que puede estar contaminado con impurezas que tienen tiempos de retención cercanos a los de la ocratoxina A. Dicho cloroformo debe sustituirse o someterse a una destilación cuidadosa, recogiendo la fracción media con un punto de ebullición de 60 ° C a 62 ° C.
5.3.10 Contabilización de las pérdidas de ocratoxina A durante la preparación de la muestra
En un matraz de fondo plano con una capacidad de 50 cm 3, coloque 30 cm 3 de cloroformo (ver 5.2.18) y 2,5 cm 3 de solución de ácido acético (ver 5.3.2.2), agregue 0,25 cm 3 de una solución de ocratoxina. A en acetonitrilo con una concentración másica de 100 ng/cm 3 (ver 5.3.3.2). Mezclar bien y retirar con cuidado 20 cm 3 de la capa de cloroformo (inferior) en un matraz de evaporación de fondo afilado con una capacidad de 50 cm 3, evitando que entre agua. Evaporar hasta obtener un residuo seco al vacío a una temperatura del baño de agua de 40 °C a 45 °C.
A continuación, continúe realizando todas las operaciones de acuerdo con 5.4.3, realice un análisis cromatográfico del concentrado resultante de acuerdo con 5.4.4 y, utilizando la característica de calibración de acuerdo con 5.3.7, calcule la concentración másica de ocratoxina A en el concentrado.
Luego, el coeficiente de transmisión de ocratoxina Ap se calcula utilizando la fórmula
(4)
V 0 - volumen de solución de ocratoxina A según 5.3.3.2, seleccionada para preparar el control
muestra, cm 3 (0,25 cm 3).
El coeficiente de paso de la ocratoxina A se determina al menos tres veces en la etapa de dominio de la técnica y luego al cambiar los lotes de reactivos. Los valores obtenidos deben cumplir los siguientes requisitos:
Cada uno de los valores obtenidos es al menos 0,7;
El valor relativo del rango de los valores obtenidos corresponde a la condición.
I max Umin I q jq ^
donde Dmax yt| min: el mayor y el menor de los valores obtenidos del coeficiente de transmisión de ocratoxina A;
d) - media aritmética de los valores obtenidos del coeficiente de transmisión de ocratoxina
Si se cumplen ambas condiciones, entonces se utiliza el valor medio aritmético del coeficiente de transmisión de ocratoxina A al calcular los resultados de la determinación utilizando la fórmula (9). De lo contrario, encuentre las razones de la pérdida de ocratoxina A y repita la determinación del coeficiente de transmisión.
Notas
1 La razón de un resultado insatisfactorio al determinar el coeficiente de transmisión puede ser una mayor velocidad de paso del eluyente a través de la columna.
2 Se debe prestar especial atención a la necesidad de determinar el coeficiente de paso de la ocratoxina A al cambiar los lotes de gel de sílice. Al cambiar a un nuevo lote de gel de sílice, se recomienda optimizar los volúmenes de eluyentes utilizados para la purificación de muestras en columna (ver 5.4.3), logrando el coeficiente de transmisión más alto. Los volúmenes encontrados en este caso se utilizan al purificar muestras en columnas fabricadas con un lote determinado de reactivo.
3 Se recomienda aclarar el coeficiente de paso de ocratoxina A para matrices específicas utilizando muestras estándar de la composición del producto con un valor certificado de la fracción de masa de ocratoxina A o analizando una muestra "limpia" (no se detecta ocratoxina A en la muestra ) a la que se le ha añadido ocratoxina A. Analizar la muestra estándar (muestra con la adición de ocratoxina A) de acuerdo con 5.4.1 - 5.4.4. Calcule el resultado del análisis (ver 5.5) y encuentre el coeficiente de paso de ocratoxina A como la relación entre el resultado obtenido y el valor certificado de la fracción de masa de ocratoxina A en la muestra estándar o la fracción de masa de ocratoxina A en la aditivo.
5.4 Rendimiento de la prueba
5.4.1 Extracción de ocratoxina A de una muestra
Se coloca una muestra del producto triturado que pesa (5,00 ± 0,01) g en un matraz de fondo plano con una capacidad de 100 cm 3. Añadir 30 cm 3 de cloroformo (ver 5.2.18) y 2,5 cm 3 de solución de ácido acético (ver 5.3.2.2), agitar vigorosamente durante 30 minutos. Pasar el extracto resultante a través de un filtro de papel doblado con cinta roja, seleccionando 20 cm 3 del filtrado para evaporación.
Si no es posible seleccionar 20 cm 3 de filtrado, seleccione el volumen máximo posible, mídalo y utilice el valor resultante en la fórmula (9).
Transferir el filtrado resultante a un matraz de fondo puntiagudo con una capacidad de 50 cm 3 y evaporar hasta obtener un residuo seco al vacío a una temperatura de baño de agua de 40 °C a 45 °C.
El residuo seco se procesa de acuerdo con 5.4.2 o 5.4.3, según el propósito de la prueba: mediante el análisis de muestras o mediante la determinación cuantitativa de la fracción de masa de ocratoxina A en una muestra en la que se detectó un pico identificado como pico de ocratoxina A. detectado durante el cribado.
Nota: cuando se analizan muestras para las cuales hay motivos para creer que están contaminadas con ocratoxina A, se permite proceder directamente a la purificación en columna de acuerdo con 5.4.3, sin pasar por el análisis.
5.4.2 Realización de análisis de muestras
El residuo seco obtenido según 5.4.1 se disuelve en 0,5 cm 3 de la fase móvil según 5.3.2.1 y se agita durante 1 minuto. Luego añadir 3 cm 3 de hexano (ver 5.2.17) y volver a mezclar vigorosamente. Después de la separación de las dos fases inmiscibles, transfiera con cuidado aproximadamente 0,3 cm 3 de la capa inferior a un tubo de micromuestra de un solo uso con una capacidad de 1,5 cm 3 (tubo Eppendorf) o similar.
Registre el cromatograma de la solución resultante de acuerdo con 5.4.4 el día de la prueba. Si se detecta un pico en el cromatograma, identificado por el software del cromatógrafo como un pico de ocratoxina A, repita las pruebas de la muestra, incluida la purificación obligatoria de acuerdo con 5.4.3.
En ausencia de un pico identificado como pico de ocratoxina A, se llega a una conclusión sobre la ausencia de ocratoxina A en la muestra al nivel del límite inferior del rango de medición (0,0025 ppm).
5.4.3 Limpieza de muestras y preparación del concentrado de muestras
El residuo seco según 5.4.1 se disuelve en 1 cm 3 de cloroformo.
Prepare la columna de vidrio según 5.3.4. Deje que el cloroformo drene hasta el nivel de sulfato de sodio anhidro y aplique la solución resultante a la columna. El matraz de fondo afilado en el que se evaporó el extracto se enjuaga dos veces con 1 cm 3 de cloroformo, que también se aplica a la columna. Después de esto, se lava la columna con 10 cm 3 de hexano y se desecha el eluato.
Luego se pasan a través de la columna 30 cm 3 de una mezcla de cloroformo y ácido fórmico (ver 5.3.2.3) a una velocidad de no más de una gota por segundo, eluyendo la ocratoxina A. Todo el eluato se recoge en un matraz puntiagudo y se evapora. hasta sequedad al vacío a una temperatura de baño de agua de 40 °C a 45 °C.
El residuo seco se disuelve en 0,5 cm 3 de la fase móvil (ver 5.3.2.1) y se agita durante 1 minuto. Luego añadir 3 cm 3 de hexano y volver a mezclar vigorosamente. Después de la separación de las dos fases inmiscibles, transfiera con cuidado aproximadamente 0,3 cm 3 de la capa inferior a un tubo de micromuestra de un solo uso con una capacidad de 1,5 cm 3 (tubo Eppendorf) o similar. El concentrado resultante se utiliza para mediciones cromatográficas de acuerdo con 5.4.4 el día de la prueba.
Por ejemplo, la columna Lichrospher® 100 RP 18 es un ejemplo de producto comercial que cumple con estos requisitos. Esta información se proporciona para comodidad de los usuarios de esta norma y no constituye un respaldo del producto especificado.
El pico corresponde a un contenido de ocratoxina A de 0,0042 ppm.
* Un ejemplo de producto comercial que cumple con estos requisitos es una columna cromatográfica con un diámetro interno de 2,1 mm y una longitud de 120 mm, llena con un sorbente de fase inversa Kromasil S-18 con un tamaño de partícula de 5 μm, equipada con una precolumna de 25 mm de largo. Esta información se proporciona para comodidad de los usuarios de esta norma y no constituye un respaldo del producto especificado.
Las ocratoxinas son producidas por algunos tipos de hongos. Aspergilo Y Penicillium. Los principales productores son A.ochraceus Y P. viridicatum. Estos hongos se encuentran en todas partes. Aspergilo produce ocratoxinas a temperaturas y humedad elevadas, y Penicillium ya a 5ºС. Las ocratoxinas son compuestos altamente tóxicos con un efecto teratogénico pronunciado.
Las ocratoxinas A, B y C son un grupo de compuestos estructuralmente similares que son isocomarinas asociadas con l-Enlace peptídico de fenilalanina. Dependiendo de la naturaleza de los radicales se forman varios tipos de ocratoxinas (Tabla 2.3.).
La ocratoxina A es una sustancia cristalina incolora, ligeramente soluble en agua, moderadamente soluble en disolventes orgánicos polares (metanol, cloroformo), así como en una solución acuosa de carbonato de sodio. En su forma químicamente pura es inestable y muy sensible a la luz y al aire, pero en solución de etanol puede permanecer sin cambios durante mucho tiempo. En luz ultravioleta tiene fluorescencia verde.
La ocratoxina B es una sustancia cristalina, análoga a la ocratoxina A, que no contiene un átomo de cloro. Es aproximadamente 50 veces menos tóxico que la ocratoxina A. Tiene una fluorescencia azul con luz ultravioleta.
La ocratoxina C es una sustancia amorfa, el éster etílico de la ocratoxina A, de toxicidad cercana, pero no se ha encontrado como contaminante natural de alimentos y piensos. En U-light tiene una fluorescencia de color verde pálido.
Las ocratoxinas pertenecen a micotoxinas tóxicas, tienen una alta toxicidad para el hígado, los riñones, propiedades teratogénicas e inmunosupresoras y un efecto hemolítico pronunciado. De las ocratoxinas, la más tóxica es la ocratoxina A (LD 50 = 3,4 mg/kg, (pollitos de un día, por vía oral)). Es más tóxico que las aflatoxinas. Otras micotoxinas de este grupo son un orden de magnitud menos tóxicas.
Los mecanismos de acción bioquímicos, moleculares y celulares de las ocratoxinas no se han estudiado suficientemente. Se sabe que la ocratoxina A inhibe la síntesis de proteínas y el metabolismo de los carbohidratos, en particular la gliconogénesis, al inhibir la actividad de la fenilalanina (t-ARN), una enzima específica que desempeña un papel clave en la etapa inicial de la síntesis de proteínas.
La ocratoxina A se encuentra en el maíz, la cebada, el trigo, la avena y la cebada. Un hecho importante y peligroso es que cuando los cereales forrajeros y los piensos están muy contaminados, la ocratoxina A se encuentra en los productos pecuarios (jamón, tocino, salchichas). La ocratoxina B es rara. Las ocratoxinas también afectan a todos los frutos de cultivos hortícolas. Las manzanas se ven especialmente afectadas: hasta el 50% de la cosecha puede estar contaminada con micotoxinas.
Cabe señalar que las ocratoxinas son compuestos estables. Por ejemplo, con el calentamiento prolongado del trigo contaminado con ocratoxina A, su contenido disminuyó sólo un 32% (a una temperatura de 250 a 300ºС). Así, la prevalencia en los alimentos, la toxicidad y la persistencia de las ocratoxinas suponen un peligro real para la salud humana.
Métodos de análisis
La ocratoxina A se encuentra en los alimentos oxidados. Es fácilmente soluble en muchos disolventes orgánicos que se utilizan para la extracción. El más utilizado es la extracción con cloroformo y una solución acuosa de ácido fosfórico, seguida de la purificación en columna y la cuantificación mediante el método TLC.
También se ha desarrollado un método de HPLC. Antes del análisis por HPLC, la muestra se prepara de la siguiente manera. La muestra triturada se trata con una mezcla de ácido clorhídrico 2 M y una solución de cloruro de magnesio 0,4 M. Después de la homogeneización, extraer con tolueno durante 60 minutos. La mezcla se centrifuga. El centrifugado se pasa a través de una columna de gel de sílice y se lava con una mezcla de tolueno y acetona (fase móvil). La ocratoxina A se eluye con una mezcla de tolueno y ácido acético (9:1) y se seca a 40°C. El residuo se disuelve y se filtra. El análisis se lleva a cabo mediante HPLC.
Además, se han desarrollado varios bioensayos con camarones y bacterias, pero los resultados obtenidos no permitieron el uso de estos métodos para la determinación de ocratoxinas.
Concentración de ocratoxina A en la muestra, mg/kg
Límites de error relativos (indicador de precisión) (±d), %, R = 0,95
Desviación estándar de repetibilidad (s r), %
Límite de repetibilidad ( r), %
Integridad de la extracción de sustancias, %
4.2. Equipo auxiliar
Aparato para agitar muestras tipo AVU-6S o similar
Rotavapor IR-1M con trampa o similar
Armario eléctrico de secado de laboratorio con error de mantenimiento de temperatura ±2,5 en el rango de 50 a 350 °C
refrigerador doméstico
Molino eléctrico de laboratorio EM-3A o medidor de pH similar
TU 46-22-236-79
Agitador magnético tipo MM 5 con varilla agitadora
TU 25-11.834-80
Matraces cónicos de fondo plano de 250 cm3 con NSh 29, tipo KnKSh 250-29/32
GOST 10394-74
Botellas de vidrio para atornillar de vidrio oscuro (vil), volumen 7 cm3
Matraces aforados de capacidad 100, 500, 1000 cm3 tipo 2-100-2,2-500-2
Embudos de laboratorio
Matraces en forma de pera de 10 cm3 con NSh 14,5, tipo GrKSh-10-14/23
GOST 10394-72
4.3. Reactivos y materiales.
. Preparándose para tomar medidas
5.1. Preparación de soluciones estándar de ocratoxina A.
Para preparar una solución de almacenamiento estándar (la concentración de ocratoxina A es de 10 ng/μl), se colocan una muestra de 5 mg de ocratoxina A cristalina en un matraz volumétrico de 500 cm3, 50 cm3 de una mezcla de ácido tolueno-acético (98:2% vol. ) se agrega, se mezcla bien hasta la completa disolución de la sustancia y se lleva la misma mezcla de solventes a la marca. Para establecer la concentración exacta de la solución de almacenamiento, se mide su densidad óptica a una longitud de onda de 333 nm (D333). La concentración de la solución se calcula mediante la fórmula:
Preparar soluciones de trabajo de ocratoxina A con una concentración de 0,005; 0,05 y 0,1 ng/μl, tomar 50, 500 y 1000 μl de una solución con una concentración de 0,5 ng/μl respectivamente, evaporar hasta sequedad y disolver en 5 cm3 de fase móvil.
La solución de almacenamiento de ocratoxina A se conserva en un recipiente de vidrio con tapón esmerilado en un lugar oscuro y fresco (a una temperatura de aproximadamente 0 °C) durante un máximo de un año y se utiliza para preparar soluciones estándar de trabajo. Las soluciones estándar de trabajo se almacenan en viales de vidrio oscuro en un lugar oscuro y fresco (a una temperatura de aproximadamente 0 °C) durante 1 mes.
Antes de utilizar soluciones estándar de trabajo, se deben llevar a temperatura ambiente y solo entonces se deben abrir las tapas.
5.2. Preparación de solución tampón de fosfato, pH = 7,4
Una muestra de fosfato de sodio disustituido 12-agua que pesa 1,15 g, una muestra de sodio monosustituido 2-agua que pesa 0,124 gy una muestra de cloruro de sodio que pesa 1,74 g se transfieren a un matraz aforado con una capacidad de 100 cm3, agregue 10 - 20 cm3 de agua destilada. Revuelva y ajuste el volumen de solución en el matraz hasta la marca. Vida útil: 1 mes en frigorífico.
5.3. Preparación de mezclas de disolventes.
tolueno-vinagre ácido (98:2
%
acerca de.).
Añadir 20 cm3 de ácido acético a un matraz aforado de 1000 cm3 y, agitando, ajustar hasta la marca con tolueno. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
acetonitrilo-agua (60:40
%
acerca de.).
Añadir 600 cm3 de acetonitrilo a un matraz aforado de 1000 cm3 y, sin dejar de agitar, añadir agua hasta la marca. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
acetonitrilo-agua (60:40
%
acerca de.;
pH = 3
,0
).
Añadir 600 cm3 de acetonitrilo a un matraz aforado de 1000 cm3 y, agitando, llevar hasta la marca con agua bidestilada. Añadiendo ácido fosfórico, el pH de la mezcla se ajusta a un valor de 3,0. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
Metanol-vinagre ácido (98:2
%
acerca de.).
Añadir 20 cm3 de ácido acético a un matraz aforado de 1000 cm3 y, agitando, llevar hasta la marca con metanol. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
. Selección y preparación de muestras para análisis.
6.1. Muestreo
Para tener en cuenta las características específicas del muestreo de ciertos tipos de productos, uno debe guiarse por la documentación técnica y reglamentaria vigente:
"Maíz. Reglas de aceptación y métodos de muestreo" GOST 13586.3-83;
"Sémola. Reglas de aceptación y métodos de muestreo" GOST 26312.1-84;
“Harina y salvado. Métodos de aceptación y muestreo" GOST 27668-88;
“Productos alimenticios enlatados. Muestreo y preparación para la prueba" GOST 8756.0-70.
Las muestras para análisis, representativas de la concentración de micotoxinas para todo el lote, deben tomarse de una muestra promedio (inicial) prehomogeneizada que pese 2 kg.
6.2. Preparación de muestras para análisis.
Las muestras seleccionadas se trituran durante 1 a 2 minutos en un molino de laboratorio. En este caso se utilizan dos muestras paralelas.
6.2.1. Extracción
Se colocan 25 g de muestra triturada en un matraz cónico de fondo plano de 250 cm y se añaden 100 cm3 de una mezcla de acetonitrilo-agua (60:40% vol.). Extraer usando un agitador de muestras durante 30 minutos. La mezcla resultante se filtra a través de un filtro de papel doblado con cinta azul. Tomar 10 cm3 de filtrado y añadir 90 cm de solución tampón fosfato, pH = 7,4.
6.2.2. Purificación de extractos
Se aplican 100 ml de la mezcla resultante a la columna de inmunoafinidad a una velocidad de 1 a 2 gotas por segundo, se lavan con 20 cm3 de solución tampón fosfato, pH = 7,4. La ocratoxina A se eluye con 3 cm3 de una mezcla de metanol-ácido acético (98:2% vol.).
. tomando medidas
7.1. Preparación de la muestra de prueba.
El eluato se evapora hasta sequedad. El residuo seco se disuelve en 400 µl de la fase móvil (solución A).
7.2. Condiciones de cromatografía
Condiciones de HPLC: fase móvil - acetonitrilo-agua (60:40 % vol.; pH = 3,0); velocidad de la fase móvil - 1,5 cm3/min.
El detector fluorimétrico se ajusta a una longitud de onda de radiación excitante de 333 nm y en la línea de emisión se instala un filtro de emisión con una banda de paso de 466 nm.
Para analizar las muestras, se inyectan 50 µl de una muestra de prueba (solución A) en el inyector del cromatógrafo utilizando una microjeringa. Si hay un pico que coincide en el tiempo de retención con la ocratoxina A, la masa de ocratoxina A en la inyección se calcula mediante un gráfico de calibración.
. Procesamiento de resultados de medición
8.1. Construcción de una relación graduada
Para construir una curva de calibración, se realiza un análisis cromatográfico de una serie de soluciones de trabajo de estándares. Se inyectan en el inyector 50 μl de una solución estándar de trabajo con una concentración de 0,005 ng/μl mediante una microjeringa, lo que corresponde a 0,25 ng de ocratoxina A. Se hace lo mismo con otras soluciones estándar con concentraciones de 0,05 y 0,10 ng/μl. , que a su vez corresponde a 2,5 y 5,0 ng de ocratoxina A en la inyección. En estas condiciones, el tiempo de retención de la ocratoxina A está en el intervalo de 4 a 5 minutos. A partir de los datos obtenidos se construye un gráfico de calibración (dependencia del área del pico cromatográfico de la masa de ocratoxina A en la inyección).
El resultado del análisis se presenta en la forma (con probabilidad R = 0,95):
D - límite de error absoluto:
d es el límite del error relativo de la técnica (indicador de precisión), % (Tabla 1).
* 0,0001 mg/kg es el límite de detección.
. Requisitos de calificación del artista intérprete o ejecutante
Las personas con educación superior especial o educación secundaria especializada que dominen las técnicas de análisis HPLC, hayan recibido la capacitación adecuada y tengan experiencia trabajando en un laboratorio químico pueden realizar el análisis de ocratoxina A en cereales y productos de cereales.
. Condiciones de medición
Temperatura ambiente de 15 a 25 °C.
Humedad relativa del aire no más del 80% a 25 °C.
Presión atmosférica 730 - 760 mm Hg.
Tensión de alimentación: 210 - 220 V. Frecuencia CA: 45 - 50 Hz.
Concentración de ocratoxina A en la muestra, mg/kg
Límites de error relativos (indicador de precisión) (±d), %, R = 0,95
Desviación estándar de repetibilidad (s r), %
Límite de repetibilidad ( r), %
Integridad de la extracción de sustancias, %
4. Instrumentos de medida, dispositivos auxiliares, cristalería, reactivos y materiales.
4.1. Instrumentos de medida
4.2. Equipo auxiliar
Aparato para agitar muestras tipo AVU-6S o similar
TU 64-1-2451
Rotavapor IR-1M con trampa o similar
TU 25-11917
Armario eléctrico de secado de laboratorio con error de mantenimiento de temperatura ±2,5 en el rango de 50 a 350 °C
TU 16-531.639
refrigerador doméstico
Molino eléctrico de laboratorio EM-3A o medidor de pH similar
TU 46-22-236-79
Agitador magnético tipo MM 5 con varilla agitadora
TU 25-11.834-80
Matraces cónicos de fondo plano de 250 cm 3 con NSh 29, tipo KnKSh 250-29/32
GOST 10394-74
Frascos de vidrio oscuro para atornillar (viles), volumen 7 cm 3
Matraces aforados, capacidad 100, 500, 1000 cm 3 tipo 2-100-2,2-500-2
Embudos de laboratorio
Matraces en forma de pera de 10 cm 3 con NSh 14,5, tipo GrKSh-10-14/23
GOST 10394-72
4.3. Reactivos y materiales.
Fosfato de sodio, monosustituido, 2 agua, grado analítico
Cloruro de sodio, grado reactivo
Acetonitrilo, grado de pureza especial, grado 0
Metanol, pureza especial.
Ácido fosfórico, pureza especial.
TU 2612-014-00203677-97
Ácido acético glacial, grado reactivo
Tolueno, grado analítico
Columnas de inmunoafinidad Ochraprep (R-Biopharm, Reino Unido)
. Preparándose para tomar medidas
5.1. Preparación de soluciones estándar de ocratoxina A.
Para preparar una solución de almacenamiento estándar (concentración de ocratoxina A - 10 ng/μl), se colocan una muestra de 5 mg de ocratoxina A cristalina en un matraz volumétrico de 500 cm 3, 50 cm 3 de una mezcla de ácido tolueno-acético (98:2% vol.), agitar con cuidado hasta que la sustancia se disuelva por completo y diluir con la misma mezcla de disolventes hasta la marca. Para establecer la concentración exacta de la solución de almacenamiento, se mide su densidad óptica a una longitud de onda de 333 nm (D 333). La concentración de la solución se calcula mediante la fórmula:
A continuación, se diluyen 5 cm 3 de una solución estándar de ocratoxina A con una concentración de 10 ng/μl con una mezcla de ácido tolueno-acético (98:2 % vol.) hasta un volumen de 100 cm 3, obteniéndose una solución de trabajo. con una concentración de 0,5 ng/μl.
Preparar soluciones de trabajo de ocratoxina A con una concentración de 0,005; 0,05 y 0,1 ng/μl, tomar 50, 500 y 1000 μl de una solución con una concentración de 0,5 ng/μl respectivamente, evaporar hasta sequedad y disolver en 5 cm 3 de fase móvil.
La solución de almacenamiento de ocratoxina A se conserva en un recipiente de vidrio con tapón esmerilado en un lugar oscuro y fresco (a una temperatura de aproximadamente 0 °C) durante un máximo de un año y se utiliza para preparar soluciones estándar de trabajo. Las soluciones estándar de trabajo se almacenan en viales de vidrio oscuro en un lugar oscuro y fresco (a una temperatura de aproximadamente 0 °C) durante 1 mes.
Antes de utilizar soluciones estándar de trabajo, se deben llevar a temperatura ambiente y solo entonces se deben abrir las tapas.
5.2. Preparación de solución tampón de fosfato, pH = 7,4
Una muestra de fosfato de sodio disustituido 12-agua que pesa 1,15 g, una muestra de sodio monosustituido 2-agua que pesa 0,124 gy una muestra de cloruro de sodio que pesa 1,74 g se transfieren a un matraz aforado con una capacidad de 100 cm 3, se agregan 10 - 20 cm 3 de agua destilada. Revuelva y ajuste el volumen de solución en el matraz hasta la marca. Vida útil: 1 mes en frigorífico.
5.3. Preparación de mezclas de disolventes.
tolueno-vinagre ácido (98:2
%
acerca de.).
Añadir 20 cm 3 de ácido acético a un matraz aforado de 1000 cm 3 y, agitando, ajustar hasta la marca con tolueno. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
acetonitrilo-agua (60:40
%
acerca de.).
Añadir 600 cm 3 de acetonitrilo a un matraz aforado de 1000 cm 3 y, agitando, llevar hasta la marca con agua. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
acetonitrilo-agua (60:40
%
acerca de.;
pH = 3
,0
).
Añadir 600 cm 3 de acetonitrilo a un matraz aforado de 1000 cm 3 y, agitando, llevar hasta la marca con agua bidestilada. Añadiendo ácido fosfórico, el pH de la mezcla se ajusta a un valor de 3,0. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
Metanol-vinagre ácido (98:2
%
acerca de.).
Añadir 20 cm 3 de ácido acético a un matraz aforado de 1000 cm 3 y, agitando, llevar hasta la marca con metanol. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
. Selección y preparación de muestras para análisis.
6.1. Muestreo
Para tener en cuenta las características específicas del muestreo de ciertos tipos de productos, debe guiarse por la documentación técnica y reglamentaria vigente:
"Maíz. Reglas de aceptación y métodos de muestreo" GOST 13586.3-83;
"Sémola. Reglas de aceptación y métodos de muestreo" GOST 26312.1-84;
“Harina y salvado. Métodos de aceptación y muestreo" GOST 27668-88;
“Productos alimenticios enlatados. Muestreo y preparación para la prueba" GOST 8756.0-70.
Las muestras para análisis, representativas de la concentración de micotoxinas para todo el lote, deben tomarse de una muestra promedio (inicial) prehomogeneizada que pese 2 kg.
6.2. Preparación de muestras para análisis.
Las muestras seleccionadas se trituran durante 1 a 2 minutos en un molino de laboratorio. En este caso se utilizan dos muestras paralelas.
6.2.1. Extracción
Se colocan 25 g de muestra triturada en un matraz cónico de fondo plano de 250 cm y se añaden 100 cm 3 de una mezcla de acetonitrilo-agua (60:40 % vol.). Extraer usando un agitador de muestras durante 30 minutos. La mezcla resultante se filtra a través de un filtro de papel doblado con cinta azul. Se toman 10 cm 3 de filtrado y se añaden 90 cm de solución tampón fosfato, pH = 7,4.
6.2.2. Purificación de extractos
Se aplican 100 ml de la mezcla resultante a la columna de inmunoafinidad a una velocidad de 1 a 2 gotas por segundo, se lavan con 20 cm 3 de solución tampón fosfato, pH = 7,4. La ocratoxina A se eluye con 3 cm 3 de una mezcla de metanol-ácido acético (98:2% vol.).
. tomando medidas
7.1. Preparación de la muestra de prueba.
El eluato se evapora hasta sequedad. El residuo seco se disuelve en 400 µl de la fase móvil (solución A).
7.2. Condiciones de cromatografía
Condiciones de HPLC: fase móvil - acetonitrilo-agua (60:40 % vol.; pH = 3,0); velocidad de la fase móvil - 1,5 cm 3 /min.
El detector fluorimétrico se ajusta a una longitud de onda de radiación excitante de 333 nm y en la línea de emisión se instala un filtro de emisión con una banda de paso de 466 nm.
Para analizar las muestras, se inyectan 50 µl de una muestra de prueba (solución A) en el inyector del cromatógrafo utilizando una microjeringa. Si hay un pico que coincide en el tiempo de retención con la ocratoxina A, la masa de ocratoxina A en la inyección se calcula mediante un gráfico de calibración.
. Procesamiento de resultados de medición
8.1. Construcción de una relación graduada
Para construir una curva de calibración, se realiza un análisis cromatográfico de una serie de soluciones de trabajo de estándares. Se inyectan en el inyector 50 µl de una solución estándar de trabajo con una concentración de 0,005 ng/μl mediante una microjeringa, lo que corresponde a 0,25 ng de ocratoxina A. Se hace lo mismo con otras soluciones estándar con concentraciones de 0,05 y 0,10 ng/μl. , que a su vez corresponde a 2,5 y 5,0 ng de ocratoxina A en la inyección. En estas condiciones, el tiempo de retención de la ocratoxina A está en el intervalo de 4 a 5 minutos. A partir de los datos obtenidos se construye un gráfico de calibración (dependencia del área del pico cromatográfico de la masa de ocratoxina A en la inyección).
8.2. Registro de resultados
La concentración de ocratoxina A en la muestra se calcula mediante la fórmula:
C (guardia A)- concentración de ocratoxina A en la muestra, mg/kg;
METRO- masa de muestra para análisis, g (25,0);
t- masa de ocratoxina A correspondiente al volumen de solución A introducida en el cromatógrafo, ng;
V 1
- volumen de solución para extracción, cm 3 (100);
D - límite de error absoluto:
d - límite del error relativo del método (indicador de precisión), % (Tabla 1).
Si el contenido de ocratoxina A en la muestra es inferior al límite inferior del rango de concentraciones determinadas, el resultado del análisis se presenta como:
* 0,0001 mg/kg es el límite de detección.
8.3. Comprobación de la aceptabilidad de los resultados de determinaciones paralelas
Discrepancia permitida entre mediciones paralelas (R) se determinan en función del límite de repetibilidad (r) (Tabla 1):
R = 0,01 (r, %) × , mg/kg
Si la discrepancia entre definiciones paralelas no excede el límite permitido:
luego se toma la media aritmética como resultado del análisis.
Si se excede el estándarRLas mediciones deben repetirse utilizando muestras de reserva.
. Control de calidad de los resultados de las mediciones.
La frecuencia del seguimiento de los errores de medición depende del número de mediciones de trabajo durante el período controlado y está determinada por los planes de control.
Las muestras de control son muestras de trabajo de materias primas alimentarias y productos alimenticios. Toma una muestra y divídela en 2 partes iguales. Uno de ellos se deja sin cambios y al otro se le agrega una cantidad tal de solución estándar de ocratoxina que su fracción de masa en la muestra aumenta entre un 50 y un 100% en comparación con el valor inicial. El aditivo debe introducirse en la muestra antes de que comience la preparación de la muestra.
Ambas muestras se analizan estrictamente de acuerdo con las instrucciones metodológicas y se obtienen los resultados del análisis de la muestra original ( C (negativo A)) y muestras con aditivo ( CON
¢
(negativo A)). La determinación se realiza en las mismas condiciones, es decir: el análisis lo realiza un solo analista, utilizando un juego de material de vidrio volumétrico, reactivos, soluciones, etc.
El algoritmo para realizar el control de errores operacionales utilizando el método aditivo consiste en comparar el resultado de una determinación de control igual a la diferencia entre el resultado de una medición de control de una muestra con un aditivo ( CON
¢
(ocre)), muestras sin aditivos ( C (guardia A)) y la cantidad de aditivo ( Con ext(guardia A)) con estándares de control operativo (k). La decisión sobre un error satisfactorio se toma cuando se cumple la siguiente condición (si R yTemperatura ambiente de 15 a 25 °C.
Humedad relativa del aire no más del 80% a 25 °C.
Presión atmosférica 730 - 760 mm Hg.
Tensión de alimentación: 210 - 220 V. Frecuencia CA: 45 - 50 Hz.
5.8 Registro de resultados de pruebas
Los resultados de la prueba se registran en un informe de prueba, que se redacta de acuerdo con los requisitos de GOST ISO/IEC 17025, y el informe de prueba debe contener una referencia a esta norma.
Los resultados de las mediciones del contenido de ocratoxina A (si se confirma que el procedimiento analítico cumple con los requisitos de esta norma en el laboratorio) se presentan en el formulario
X±D, millón" 1 o X±U, millón" 1, (12)
donde X es el resultado de la medición obtenido de acuerdo con 5,6, millones" 1;
A - límites de error absoluto en la medición del contenido de ocratoxina A (P = 0,95) según
cuadro 2, millones" 1;
U - incertidumbre ampliada en el factor de cobertura k = 2, millones" 1.
Los valores numéricos de los límites de error absoluto (incertidumbre) se expresan como un número que contiene no más de dos cifras significativas, y el dígito más pequeño del valor numérico del resultado final de la medición se considera igual al dígito más pequeño. del valor numérico de los límites del error absoluto (incertidumbre).
6 Método B
6.1 Esencia del método
El método se basa en la extracción de ocratoxina A con tolueno después de acidificar la muestra de prueba con ácido clorhídrico y agregar cloruro de magnesio para aumentar la fuerza iónica. El extracto se purifica mediante columnas de extracción en fase sólida llenas de gel de sílice y el contenido de ocratoxina A se determina mediante HPLC en fase inversa mediante detección fluorimétrica. Si es necesario, confirme la identificación de la ocratoxina A mediante derivatización con una solución de trifluoruro de boro en metanol.
6.2 Reactivos
Al realizar pruebas, utilice agua según 5.2.13, reactivos según 5.2.14 - 5.2.17, así como lo siguiente.
6.2.7 Disolvente mixto N° 1: tolueno (ver 6.2.3) y ácido acético glacial (ver 5.2.15) en una relación en volumen de 99:1.
6.2.8 Disolvente mixto N° 2: acetona (ver 6.2.5) y tolueno (ver 6.2.3) en una proporción en volumen de 5:95.
6.2.9 Disolvente mixto N° 3: tolueno (ver 6.2.3) y ácido acético glacial (ver 5.2.15) en una relación en volumen de 90:10.
6.2.10 Fase móvil
Mezclar 99 partes en volumen de acetonitrilo (ver 5.2.16) con 99 partes en volumen de agua (ver 5.2.13) y dos partes en volumen de ácido acético glacial (ver 5.2.15). Antes de su uso, se desgasifica la fase móvil.
6.2.11 Trifluoruro de boro, fracción másica de la sustancia principal no inferior a
6.2.12 Solución de trifluoruro de boro en metanol, p (BF 3) = 14 g/100 cm 3.
¡ATENCIÓN! Es necesario trabajar en una campana extractora que funcione bien. Debe evitarse el contacto con la piel, los ojos y los órganos respiratorios.
6.2.13 Ocratoxina A en forma cristalina o en forma de ampolla en forma de película con una fracción de masa de la sustancia principal de al menos el 95%
6.2.14 Ocratoxina A, solución madre
Disuelva 1 mg de ocratoxina A cristalina (ver 6.2.13) o el contenido de una ampolla de película que contenga ocratoxina A en un volumen tal de disolvente mixto No. 1 (ver 6.2.7) para obtener una solución con una concentración másica de ocratoxina A. de 20 a 30 μg/cm 3.
Para determinar la concentración másica exacta de ocratoxina A en la solución principal, registre su densidad óptica en el rango de longitud de onda de 300 a 370 nm con un paso de 5 nm en una cubeta de cuarzo con un espesor de capa óptica de 1 cm de acuerdo con 6.3.2 usando un espectrofotómetro (ver 6.3.1). Como solución de referencia se utiliza el disolvente mixto nº 1 según 6.2.7. La posición exacta del máximo de absorción se identifica registrando la densidad óptica cerca de él en incrementos de 1 nm. Calcular el valor de la concentración másica de ocratoxina A, C ref, μg/cm 3, según la fórmula
donde A max es la densidad óptica en el máximo de absorción (en este caso a 333 nm);
M es la masa molar de ocratoxina A, g/mol (M=403,8 g/mol);
100 - coeficiente de coordinación de unidades de longitud y masa; e - coeficiente de absorción molar de ocratoxina A en disolvente mixto N° 1, m 2 /mol, (e = 544 m 2 /mol);
/ es el espesor de la capa absorbente de la cubeta, cm.
6.2.15 Ocratoxina A, solución intermedia con una concentración másica de 1 μg/cm 3 Evaporar hasta sequedad en una corriente de nitrógeno una alícuota de la solución inicial (ver 6.2.14) que contiene 100 μg de ocratoxina A y disolver en 100 cm 3 de la fase móvil (ver 6.2.10). El volumen de la alícuota se calcula mediante la fórmula:
\/ a - volumen alícuota, cm 3;
100 - masa de ocratoxina A, µg;
Cie* es la concentración másica de la solución inicial de ocratoxina A según 6.2.14, μg/cm 3 .
La vida útil de la solución en el frigorífico a una temperatura de 2°C a 6°C y control periódico de su estabilidad no supera los 6 meses.
6.2.16 Soluciones de calibración de ocratoxina A
Colocar 1 en matraces aforados con capacidad de 100 cm 3; 2,5; 4 y 5 cm 3 de la solución intermedia de ocratoxina A (ver 6.2.15) y diluir hasta la marca con la fase móvil (ver 6.2.10). La concentración másica de ocratoxina A en las soluciones de calibración preparadas es 10; 25; 40 y 50 ng/cm 3 respectivamente, lo que corresponde a una masa de ocratoxina A de 0,2; 0,5; 0,8 y 1,0 ng en un volumen de dosificación de 20
6.3 Instrumentos de medida, equipos auxiliares, materiales y utensilios
Al realizar pruebas, se utilizan instrumentos de medición, equipos auxiliares, materiales y utensilios de acuerdo con 5.2.1 - 5.2.2, 5.2.6 - 5.2.11, 5.2.21 -5.2.34, así como lo siguiente.
6.3.1 Espectrofotómetro, adecuado para mediciones en el rango de longitud de onda de 300 a 370 nm y que tenga un ancho de banda espectral no superior a 2 nm.
6.3.2 Cubetas de cuarzo con una capa absorbente de 1 cm de espesor, que no absorben luz en el rango de longitud de onda de 300 a 370 nm.
6.3.3 Tubos de centrífuga, por ejemplo de 250 cm 3 de capacidad, fabricados en polietileno de alta densidad con tapón de rosca.
6.3.4 Centrífuga refrigerada, preferentemente refrigerada, para tubos de centrífuga (ver 6.3.3), capaz de generar una aceleración de al menos 3 500 g.
NOTA La velocidad de rotación de la centrífuga que proporciona la aceleración especificada se selecciona de acuerdo con las recomendaciones del fabricante de la centrífuga.
6.3.5 Columna de extracción en fase sólida desechable llena de gel de sílice.
Después de abrir el paquete, la columna se acondiciona durante dos horas a 105 °C y se almacena sobre gel de sílice activado con un indicador de humedad. Antes de su uso, se pasan 10 cm 3 de tolueno a través de la columna (ver 6.2.3). Con cada nuevo lote de columnas se comprueba el rendimiento de ocratoxina A. Por ejemplo, son adecuadas las columnas fabricadas con tubo de polipropileno con una capacidad de 3 cm 3 con las siguientes características:
El peso medio del gel de sílice es de 690 mg;
Tamaño de poro: 12,5 nm;
El tamaño de las partículas es de 55 a 105 micrones.
6.3.6 Depósitos para disolventes, como jeringas, por ejemplo de 50 ml de capacidad, con abertura central y tapón.
6.3.7 Embudo de decantación con una capacidad de 50 cm 3 según GOST 25336.
6.3.8 Filtros de membrana para soluciones acuosas, fabricados en politetrafluoroetileno, con un tamaño de poro de 0,45 micras.
6.3.9 Viales con tapón de rosca o engarzado.
6.3.10 Microespíritus con capacidad de 500 mm 3.
6.3.11 Equipos de cromatografía líquida de alta resolución
6.3.11.1 Cromatografía líquida según 5.2.1.
Longitud................................................. ..250 milímetros;
Diámetro interior................................4 mm;
Tamaño de partícula esférica........................5 micras.
6.3.11.2 Columna cromatográfica analítica, llena de un sorbente de fase inversa con un tamaño de grano de 5 µm, que garantiza la separación del pico de ocratoxina A y otros picos hasta la línea base 1 con las siguientes características:
Nota: está permitido utilizar columnas analíticas de otros tamaños (por ejemplo, de 120 a 150 mm de largo).
6.3.11.3 Precolumna del mismo diámetro interno y rellena con la misma dirección de frente
sorbente de fase, de la misma longitud que la columna analítica
6.3.11.4 Precolumna del mismo diámetro interno y llena del mismo sorbente de fase inversa que la columna analítica, por ejemplo, con las siguientes características:
Longitud................................................. ...40 milímetros;
Diámetro interior................................4 mm;
Tamaño de partícula esférica........................5 micras.
Nota - Se permite el uso de precolumnas de otros tamaños estándar.
Se permite el uso de otros instrumentos de medida con características metrológicas y equipos auxiliares con características técnicas no peores, así como materiales y reactivos de no inferior calidad a los anteriores.
6.4 Rendimiento de la prueba
6.4.1 Generalidades
Las pruebas deben completarse dentro de un día hábil.
6.4.2 Extracción de ocratoxina A de la muestra
Coloque (20,0 ± 0,1) g de la muestra preparada para la prueba de acuerdo con la cláusula 3 en un tubo de centrífuga (ver 6.3.3). Si el contenido de ocratoxina esperado es superior a 0,005 ppm, el peso de la muestra se reduce a 10 g; de lo contrario, se debe tener en cuenta el posible riesgo de una reducción de la recuperación de ocratoxina A de la muestra;
Agregue secuencialmente 30 cm 3 de solución de ácido clorhídrico (ver 6.2.1), 50 cm 3 de solución de cloruro de magnesio (ver 6.2.2), revuelva con una varilla de vidrio y agregue 100 cm 3 de tolueno.
Agitar durante 60 minutos y luego centrifugar la suspensión. El tiempo de centrifugación depende de la eficiencia de la centrífuga. La centrifugación se lleva a cabo mientras se enfría para evitar la pérdida de tolueno. Tome una alícuota de 50 cm 3 de la capa superior (tolueno) (y 2) y pásela a través de una columna de extracción en fase sólida preparada de acuerdo con 6.3.5 con un depósito conectado a ella (ver 6.3.6).
Nota: se debe tener cuidado para evitar sobrecargar la columna.
La columna se lava con dos porciones de 10 cm 3 de hexano (ver 5.2.17) y luego con dos porciones de disolvente mixto No. 2 (ver 6.2.8). Luego lavar con 5 cm 3 de tolueno, desechando todos los eluatos.
Eluir la ocratoxina A con dos porciones de 15 cm 3 de disolvente mixto N° 3 (ver 6.2.9) en un matraz de fondo puntiagudo de 50 cm 3 (ver 5.2.25). El eluato combinado se evapora cuidadosamente hasta obtener un residuo seco bajo presión reducida y una temperatura que no exceda los 40°C. El residuo se disuelve en 1 cm 3 (\/ 3) de la fase móvil (ver 6.2.10) y se transfiere a un vial (ver 6.3.9).
Notas
1 Las condiciones para la elución de la ocratoxina A y las operaciones posteriores pueden depender del tipo de columna de extracción en fase sólida utilizada. Por ejemplo, debería comprobar si el volumen de eluyente especificado anteriormente es apropiado para el tipo de columna utilizada.
2 El tamaño y/o la forma del matraz pueden tener un efecto negativo en el rendimiento de ocratoxina A.
6.4.3 Condiciones para el análisis cromatográfico
La lisis se lleva a cabo en las siguientes condiciones:
Caudal de la fase móvil....1 cm 3 /min;
Longitud de onda de excitación de fluorescencia....330 nm;
Longitud de onda de registro de fluorescencia...460 nm;
Volumen de dosificación...................................20 mm 3.
6.4.4 Calibración del cromatógrafo
Si se utiliza una columna según 6.3.11.2 y una fase móvil según 6.2.10, el análisis cromatográfico
El cromatógrafo se calibra al dominar la técnica y en el futuro en todos los casos en que cambien las condiciones de análisis cromatográfico.
Se introducen en el cromatógrafo al menos cuatro soluciones de calibración con diferentes concentraciones másicas de ocratoxina A (ver 6.2.16). El volumen de dosificación de cada solución de calibración debe ser el mismo.
La característica de calibración se establece como la dependencia del área o altura del pico de la masa de ocratoxina A en el volumen inyectado.
Verifique la linealidad de la característica de calibración establecida utilizando el coeficiente de correlación (ver 5.3.7). Todos los días antes de comenzar a trabajar, verificar la estabilidad de la característica de calibración de la misma manera que en 5.3.8, utilizando una solución de calibración de ocratoxina A con una concentración másica de 25 ng/cm 3 (ver 6.2.16).
6.4.5 Identificación de la ocratoxina A
El pico de ocratoxina A se identifica comparando los tiempos de retención de los picos en el cromatograma de la muestra y las soluciones de calibración. En algunos casos, puede ser necesario introducir la muestra con la adición de una solución de ocratoxina A en la fase móvil (ver 5.4.4).
6.4.6 Cuantificación
La solución de muestra preparada según 6.4.2 se introduce inmediatamente en el cromatógrafo. El volumen de dosificación debe ser igual al volumen de dosificación de las soluciones de calibración al calibrar el cromatógrafo (ver 6.4.4).
Mida el área o la altura del pico de ocratoxina A en el cromatograma de la muestra y, utilizando la característica de calibración (ver 6.4.4), encuentre su masa (/n-i, ng) en el volumen inyectado.
Si el valor de respuesta de ocratoxina A en el cromatograma de muestra está fuera de la característica de calibración, entonces la solución de muestra preparada se diluye o concentra antes de ingresar al cromatograma, teniendo en cuenta este hecho al calcular los resultados de la medición de acuerdo con 6.5.
6.4.7 Confirmación
Si es necesario, confirmar la identificación del pico de ocratoxina A mediante su desaparición y la aparición simultánea de un pico con un tiempo de retención coincidente con el tiempo de retención del pico de éster metílico de ocratoxina A como resultado de la derivatización con estrifluoruro de boro.
Tomar 0,5 cm 3 de la solución preparada según 6.4.2 en un matraz de fondo puntiagudo y evaporar hasta sequedad en un rotavapor (ver 5.2.7). El residuo seco se disuelve en 1 cm 3 de cloruro de metileno (ver 6.2.4) y se añaden 2 cm 3 de una solución de trifluoruro de boro en metanol (ver 6.2.12).
El matraz se tapa herméticamente y se calienta en un baño de agua a una temperatura de 50 °C a 60 °C durante 15 minutos. Después de enfriar, la solución se transfiere a un embudo de decantación de 50 cm 3 de capacidad que contiene 30 cm 3 de agua, se agita 30 veces con tres porciones de cloruro de metileno de 10 cm 3 cada una. Combinar las fases orgánicas después de cada extracción en otro embudo de decantación de 50 cm 3 de capacidad, añadir 20 cm 3 de agua para lavado y agitar durante 30 s.
Filtrar la fase orgánica a través de una capa de sulfato de sodio anhidro (ver 5.2.14) en un matraz de fondo afilado, evaporar hasta sequedad, disolver en 500 mm 3 de la fase móvil (ver 6.2.10) y registrar el cromatograma del resultado. solución en las condiciones del apartado 6.4.3.
Para encontrar el tiempo de retención del éster metílico de ocratoxina A y verificar que la derivatización esté completa en las condiciones anteriores, trate la solución intermedia de acuerdo con 6.2.15.
6.5 Procesamiento de los resultados de las pruebas
La fracción de masa de ocratoxina A X, millones" 1 se calcula mediante la fórmula
donde Vi es el volumen de tolueno tomado para extracción según 6.4.2, cm 3 (100 cm 3);
\/ 3 - volumen de solución de muestra preparada según 6.4.2, cm 3 (1 cm 3);
mi es la masa de ocratoxina A, determinada según 6.4.6, ng;
V 2 - volumen de la alícuota centrifugada según 6.4.2, cm 3 (50 cm 3);
V 4 - volumen de dosificación de la solución de muestra preparada, cm 3;
/77 - masa de muestra tomada para la prueba, g;
10" 3 - coeficiente de coordinación de las dimensiones de las unidades de masa.
6.6 Características metrológicas
6.6.1 Los resultados de las pruebas entre laboratorios para determinar la precisión del método, realizadas de acuerdo con GOST ISO 5725-2, se dan en el Apéndice B. Los valores obtenidos como resultado de las pruebas entre laboratorios pueden no ser aplicables. en los rangos de contenidos de ocratoxina A y para matrices diferentes a las especificadas en el Apéndice B.
6.6.2 La discrepancia absoluta entre dos resultados de pruebas individuales obtenidos en condiciones de repetibilidad puede exceder el límite de repetibilidad r en no más del 5% de los casos.
Valores límite de repetibilidad g para el análisis de harina integral de trigo:
/=0,18 µg/kg (0,00018 millones" 1) en X=0,41 µg/kg (0,00041 millones" 1);
/=0,70 μg/kg (0,00070 millones" 1) en X = 1,23 μg/kg (0,00123 millones" 1).
6.6.3 La diferencia absoluta entre dos resultados de pruebas individuales obtenidos en condiciones de reproducibilidad puede exceder el límite de reproducibilidad R en no más del 5% de los casos.
Valores de los límites de reproducibilidad R al analizar harina de trigo integral: R=0,30 µg/kg (0,00030 millones" 1) a X=0,41 µg/kg (0,00041 millones" 1);
R=1,10 µg/kg (0,00110 millones" 1) en X = 1,23 µg/kg (0,00123 millones" 1).
6.7 Control de calidad de los resultados de las mediciones - según 5.7.
6.8 Registro de los resultados de las pruebas - según 5.8.
Apéndice A (referencia)
Cromatograma de ejemplo
A.1 La Figura A.1 muestra un cromatograma de ejemplo (Método A) de concentrado de muestra estándar OW-815 Ocratoxina A en trigo molido, fabricado por R-Biopharm Rhone Ltd. con una fracción de masa de ocratoxina A (0,0049 + 0,0010) millones" 1.
4 6 8 10 12 14 16 Tiempo, minutos
Figura A.1 - Ejemplo de cromatograma 2 3
Apéndice B (para referencia)
Datos de precisión
B.1 Los datos presentados en la Tabla B.1 se obtuvieron como resultado de pruebas entre laboratorios realizadas para el método B de acuerdo con GOST ISO 5725-2 por el Instituto Max von Pettenkofer (Berlín, Alemania) en muestras de harina de trigo.
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Tabla B.1 - Datos sobre la precisión del método |
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UDC 543.544.5.068.7:006.354 MKS 67.060 NEQ
Palabras clave: cereales, cereales alimentarios, cereales forrajeros, piensos compuestos, productos de procesamiento de cereales, métodos de prueba, cromatografía, cromatografía líquida de alta resolución, ocratoxina A, micotoxinas.
Firmado para su publicación el 14 de abril de 2016. Formato 60x84V 8 .
uel. horno l. 2.33. Tirada 22 ejemplares. Zach. 1070.
Elaborado en base a la versión electrónica proporcionada por el desarrollador del estándar.
FSUE "ESTÁNDARINFORME"
123995 Moscú, Granatny per., 4. www.gostinfo.ru [correo electrónico protegido]
GRANO ESTÁNDAR Y SUS PRODUCTOS DE ELABORACIÓN, PIENSOS COMPUESTOS Determinación de ocratoxina A mediante cromatografía líquida de alta resolución
INTERESTATAL
Granos y productos de su elaboración, piensos mixtos.
Determinación de ocratoxina A mediante cromatografía líquida de alta resolución.
Fecha de introducción - 2015-07-01
1 área de aplicación
Esta norma se aplica al grano y sus productos procesados y establece métodos para determinar el contenido de ocratoxina A mediante cromatografía líquida de alta resolución (en adelante HPLC) con detección fluorimétrica utilizando:
Cribado de muestras y purificación por cromatografía en columna (método A) en cereales alimentarios, harinas y productos cerealeros a base de trigo, maíz, cebada, centeno, avena y arroz, piensos y materias primas para su producción a base de cereales (tortas, harinas). en el rango de medición, fracción de masa de ocratoxina A de 0,0025 a 1,0 millones" 1;
Purificación por extracción en fase sólida (método B) en granos de cereales y harina en el rango de medición de la fracción de masa de ocratoxina A superior a 0,0004 millones" 1.
Nota -1 millón" 1 corresponde a 1 mg/kg o 1000 µg/kg.
2 referencias normativas
Esta norma utiliza referencias normativas a las siguientes normas:
De la muestra combinada se aísla una muestra de laboratorio que pesa al menos 100 g, que se muele hasta tal punto que pasa a través de un tamiz con un diámetro de orificio de 1 mm. La muestra de laboratorio molida aislada se mezcla completamente y se almacena hasta el momento de la prueba en un lugar seco y oscuro en un recipiente tapado.
Las muestras de harina se prueban sin molerlas.
4 Requisitos de seguridad
Al realizar mediciones, se deben observar los siguientes requisitos:
Seguridad eléctrica de acuerdo con GOST 12.1.019 y documentación técnica del cromatógrafo;
Seguridad contra explosiones de acuerdo con GOST 12.1.010;
Seguridad contra incendios según GOST 12.1.004;
Seguridad al trabajar con sustancias peligrosas de acuerdo con GOST 12.1.007.
ADVERTENCIA: La ocratoxina A causa daño renal y hepático y se sospecha que es carcinógena. Todo el trabajo relacionado con la preparación de muestras y la preparación de soluciones de ocratoxina A debe realizarse en una campana extractora utilizando ropa protectora, guantes y gafas de seguridad. La descontaminación del material de vidrio que ha estado en contacto con ocratoxina A se realiza con una solución de hipoclorito de sodio al 4%.
5 Método A
5.1 Esencia del método
El método se basa en la extracción de ocratoxina A de la muestra del producto analizado con cloroformo acidificado, el cribado de muestras que puedan contener ocratoxina A, la purificación de sus extractos mediante cromatografía en columna de gel de sílice y la determinación de la fracción másica de ocratoxina A mediante HPLC con fluorimétrico. detección.
5.2 Instrumentos de medida, equipos auxiliares, materiales de referencia, reactivos, cristalería y materiales
5.2.1 Cromatógrafo líquido con detector fluorimétrico o espectrofluorimétrico que proporciona excitación de fluorescencia en la región espectral (330 + 20) nm y registro.
estratificación de la intensidad de fluorescencia en la región espectral (465 ± 20) nm. El detector utilizado debe proporcionar un límite de detección de ocratoxina A no superior a 5 ng/cm 4 5
5.2.2 Balanzas no automáticas de acuerdo con GOST OIML R 76-1-2011 con límites de error absoluto permitidos de no más de ± 0,01 g.
5.2.3 Columna cromatográfica analítica, llena de un sorbente de fase inversa con un tamaño de grano de 5 μm, que tenga una eficiencia de al menos 5000 platos teóricos para el pico de ocratoxina A*.
5.2.4 Precolumna del mismo diámetro interno y llena con el mismo sorbente de fase inversa que la columna analítica.
5.2.5 Columna cromatográfica de vidrio con tapón esmerilado, de 200 mm de largo y diámetro interno de 10 mm.
5.2.6 Molinillo de muestras capaz de triturar partículas menores a 1 mm, como un molino de laboratorio.
5.2.7 Rotaevaporador tipo IR-1 M2 o similar, equipado con baño maría con controlador de temperatura en el rango de 20 °C a 50 °C.
5.2.8 Un dispositivo para mezclar muestras (agitador), que proporciona una frecuencia de agitación de hasta 120 min" 1.
5.2.9 Bomba de vacío de laboratorio, de membrana o de chorro de agua según GOST 25336, que proporciona un vacío de 2,5 a 10 kPa.
5.2.10 Armario de secado que proporcione temperaturas de hasta 200 °C.
5.2.12 Muestra estándar de la composición de una solución de ocratoxina A en acetonitrilo con una concentración másica de 50 μg/cm 5 con un error permisible de ± 2,5 μg/cm 5. Permitido usar
muestras estándar de la composición de una solución de ocratoxina A en otros disolventes, que deben tenerse en cuenta al preparar la solución inicial de acuerdo con 5.3.3.1.
5.2.13 Agua destilada según GOST 6709 o agua para análisis de laboratorio, nivel de pureza 1 según GOST ISO 3696.
5.2.22 Pipetas graduadas tipos 1-3 diseños 1(1 a) o 2(2a) 2.a clase de precisión con una capacidad de 1,2, 5 cm 5 según GOST 29227.
5.2.23 Cilindros dimensionales de las versiones 1-4 de la segunda clase de precisión con una capacidad de 25, 50, 250 cm 5 según GOST 1770.
5.2.24 Matraces aforados 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 según GOST 1770.
5.2.25 Matraces de fondo puntiagudo 0-10-14/23 y 0-50-14/23 según GOST 25336.
5.2.26 Matraces de fondo plano tipo P-1 o Kn-1 con una capacidad de 50, 100, 250 cm 5 según GOST 25336.
5.2.27 Dispensadores de pipetas monocanal de volumen variable de 100 a 1000 mm 5 con características metrológicas de acuerdo con GOST 28311.
5.2.28 Embudos de laboratorio tipo B según GOST 25336.
5.2.30 Tubo de micromuestra de un solo uso (tipo Eppendorf) con capacidad
5.2.31 Recipientes de vidrio con capacidad de 50, 250, 1000 cm 5 con tapones de vidrio esmerilado, fluoroplástico o polietileno.
5.2.32 Tamiz con un diámetro de orificio de 1,0 mm.
5.2.33 Varillas de vidrio.
5.2.34 Reloj de arena o cronómetro.
5.2.35 Filtros de papel “cinta roja”.
5.2.37 Gel de sílice para cromatografía en columna con tamaño de partícula de 100 a 200 micras. Se permite el uso de otros instrumentos de medida con características metrológicas no
peores que los anteriores y equipos y materiales auxiliares con características técnicas no peores que los anteriores.
5.3 Preparación para las pruebas
5.3.1 Preparación de cristalería
Los platos para preparar y almacenar la fase móvil se lavan únicamente con ácido sulfúrico de acuerdo con 5.2.20 (sin el uso de otros detergentes), se lavan a fondo con agua del grifo y se enjuagan con agua destilada.
El resto de la cristalería se lava con agua caliente y detergente, se enjuaga abundantemente con agua destilada y se seca en estufa a una temperatura de 105°C.
5.3.2 Preparación de soluciones auxiliares.
5.3.2.1 Preparación de la fase móvil
Colocar 5 cm 3 de ácido acético glacial (ver 5.2.15), 215 cm 3 de acetonitrilo (ver 5.2.16) en un matraz aforado de 500 cm 3 de capacidad con tapón de vidrio esmerilado, fluoroplástico o polietileno bien cerrado y diluir. hasta la marca con agua destilada. La mezcla está bien mezclada. El contacto de la fase móvil con el caucho es inaceptable.
La vida útil de la mezcla a temperatura ambiente no es más de 1 mes.
5.3.2.2 Preparación de una solución de ácido acético con una fracción en volumen del 1%.
Coloque 200 cm 3 de agua destilada y 2 cm 3 de ácido acético glacial (ver 5.2.15) en un matraz de fondo plano con una capacidad de 250 cm 3 y mezcle bien.
La vida útil de la solución a temperatura ambiente en un recipiente de vidrio con un tapón de vidrio esmerilado, fluoroplástico o polietileno bien cerrado no es más de 1 mes.
5.3.2.3 Preparación de una mezcla de cloroformo y ácido fórmico en una proporción volumétrica
Coloque 200 cm 3 de cloroformo (ver 5.2.18) y 4 cm 3 de ácido fórmico (ver 5.2.19) en un matraz de fondo plano con una capacidad de 250 cm 3. Añadir 10 g de sulfato de sodio anhidro (5.2.14). La mezcla se mezcla bien y se filtra a través de un filtro de cinta roja.
La vida útil de la mezcla a temperatura ambiente en un recipiente de vidrio con tapón de vidrio esmerilado, fluoroplástico o polietileno no es superior a 1 mes.
5.3.3 Preparación de soluciones de ocratoxina A
5.3.3.1 Preparación de una solución madre de ocratoxina A con una concentración másica de 1
Con una pipeta, tomar 1 cm 3 de una muestra estándar de la composición de una solución de ocratoxina A en acetonitrilo con una concentración másica de 50 μg/cm 3 (ver 5.2.12), colocarla en un matraz aforado con capacidad de 50 cm 3 y ajustar el volumen hasta la marca con acetonitrilo (ver 5.2.16).
La vida útil de la solución preparada en el frigorífico a una temperatura de 2°C a 6°C no es más de 6 meses.
Cuando se utiliza una muestra estándar de la composición de una solución de ocratoxina A en otros disolventes, se evapora una alícuota (1 cm3) hasta obtener un residuo seco al vacío a una temperatura de baño de agua de 40 °C a 45 °C o en una corriente. de nitrógeno. El residuo seco se disuelve en 2 cm 3 de acetonitrilo y se agita durante 1 minuto. Luego, la solución resultante se transfiere cuantitativamente a un matraz aforado de 50 cm 3 y se diluye hasta la marca con acetonitrilo.
Nota - Se permite preparar una solución madre de ocratoxina A según 6.2.14 -6.2.15 utilizando acetonitrilo en lugar de la fase móvil según 6.2.10.
5.3.3.2 Preparación de una solución de ocratoxina A en acetonitrilo con una concentración másica de 100
Colocar 5 cm 3 de solución de ocratoxina A con una concentración másica de 1 μg/cm 3 según 5.3.3.1 en un matraz aforado con una capacidad de 50 cm 3 , lo que corresponde a 1000 ng/cm 3 , y ajustar el volumen a la marcar con la fase móvil según 5.3.2.1.
La vida útil de la solución resultante en el frigorífico a una temperatura de 2°C a 6°C no supera los 3 meses.
5.3.3.3 Preparación de soluciones de calibración de ocratoxina A
La solución inicial de ocratoxina A en acetonitrilo según 5.3.3.1 se coloca en un matraz aforado con una capacidad de 50 cm 3. El volumen de solución de ocratoxina A debe cumplir con los requisitos de la Tabla 1.
Tabla 1
|
solución |
Volumen de la solución inicial según 5.3.3.1, cm 3 |
Valor nominal de concentración de masa, ng/cm 3 |
El contenido del matraz se diluye hasta la marca con la fase móvil según 5.3.2.1 de acuerdo con la Tabla 1.
La vida útil de las soluciones de calibración no supera los siete días.
Nota - Si es necesario, se permite preparar soluciones de ocratoxina A de otras concentraciones de la misma manera dentro del rango de linealidad de la característica de calibración (ver 5.3.7).
5.3.3.4 Todas las soluciones de ocratoxina A se almacenan en un refrigerador a una temperatura que no exceda los 6 °C o en un congelador a una temperatura que no exceda los -18 °C en recipientes de vidrio o fluoroplástico.
El valor real de la concentración másica de ocratoxina A en soluciones de acuerdo con 5.3.3.1 - 5.3.3.3 se calcula en función de los valores de la concentración másica de ocratoxina A según el pasaporte de muestra estándar.
Antes de su uso, las soluciones se conservan hasta que alcancen la temperatura ambiente.
5.3.4 Preparación de la columna de cromatografía de vidrio.
Se prepara una columna de cromatografía de vidrio inmediatamente antes del ensayo.
Coloque (1,0 ± 0,1) g de gel de sílice (ver 5.2.37) en un vaso con una capacidad de 50 cm3, agregue de 10 a 15 cm3 de cloroformo (ver 5.2.18) y mezcle bien. La suspensión resultante se mantiene en un vaso durante 4-5 minutos y luego la suspensión de gel de sílice se transfiere a la columna en varios pasos a través de un embudo con un diámetro de 25 o 36 mm, habiendo colocado previamente un trozo de algodón en su fondo. .
Después de que el gel de sílice se haya asentado en la columna, se vierte encima una capa de aproximadamente 2 g de sulfato de sodio anhidro (ver 5.2.14).
Mientras se trabaja con la columna, no se debe permitir que el sorbente se seque; para ello, es necesario mantener una capa de disolvente sobre el agente secante. Cuando esté lista, la columna debe llenarse con cloroformo por encima del nivel de sorbente, cerrarse con un tapón de vidrio esmerilado y la salida de la columna debe sumergirse en cloroformo.
La columna preparada se utiliza una vez.
5.3.5 Preparación del cromatógrafo
El cromatógrafo está preparado para realizar mediciones de acuerdo con el manual de funcionamiento (instrucciones).
Establezca las longitudes de onda de trabajo para la excitación y el registro de fluorescencia (ver 5.2.1). La velocidad de alimentación de la fase móvil se establece en función del tamaño de la columna, siguiendo las instrucciones del cromatógrafo y del fabricante de la columna. Por ejemplo, para la columna especificada en 5.2.3, el caudal de fase móvil recomendado es 200 mm 3 /min. Si hay termostato de columna, ajuste la temperatura a (25 ± 1) °C.
5.3.6 Condiciones para el análisis cromatográfico
Si se utiliza una columna cromatográfica según 5.2.3 y una fase móvil según 6.2.10, el análisis cromatográfico se realizará en las siguientes condiciones:
Longitud de onda de excitación de fluorescencia...................330 nm;
Longitud de onda de registro de fluorescencia...................465 nm;
Caudal de la fase móvil...................200 mm 3 /min;
Volumen de dosificación................................................ ... 20 mm 3;
Temperatura del termostato de columna (si está equipado)...(25 ± 1) °C.
Cuando se utilizan columnas de otros tamaños, el caudal de la fase móvil y el volumen de dosificación se seleccionan de acuerdo con las instrucciones del cromatógrafo y del fabricante de la columna.
5.3.7 Calibración del cromatógrafo
El rango de linealidad de la característica de calibración es de 10 a 100 ng/cm 3 . Las soluciones de calibración de ocratoxina A según 5.3.3.3 se utilizan como muestras para la calibración del cromatógrafo.
Se registran al menos dos cromatogramas de cada solución de calibración y se calibra el cromatógrafo, estableciendo los parámetros de la característica de calibración y el tiempo de retención de la ocratoxina A mediante el software del cromatógrafo.
Calcule el coeficiente de correlación y las desviaciones de los valores calculados de la concentración másica de ocratoxina A en cada punto de calibración del valor real de acuerdo con el procedimiento para preparar soluciones de calibración (ver 5.3.3.3).
La graduación se considera aceptable si:
Coeficiente de correlación no inferior a 0,998;
La desviación relativa del valor calculado de la concentración másica de ocratoxina A del valor real no supera el + 10%. En lugar de la desviación relativa, la aceptabilidad de la característica de calibración se puede evaluar mediante la desviación estándar relativa, que no debe exceder el 5%.
5.3.8 Monitoreo de la estabilidad de la característica de calibración
La estabilidad de la característica de calibración se controla diariamente antes de comenzar.
Como solución de control, utilice una solución de ocratoxina A en la fase móvil, preparada de manera similar a 5.3.3.3. La concentración másica de ocratoxina A en la muestra de control se selecciona en función del contenido esperado de ocratoxina A en las muestras de prueba; Se recomienda utilizar una solución de ocratoxina A con una concentración másica de 20 ng/cm.
Se registran al menos dos cromatogramas de la solución de control y se identifica el pico de ocratoxina A mediante el tiempo de retención con un ancho de ventana de identificación del 5%, introduciendo, si es necesario, una corrección por software del tiempo de retención del pico y utilizando la característica de calibración. , se calcula la concentración másica de ocratoxina A para cada entrada.
La convergencia de los valores del tiempo de retención y los valores de concentración másica de ocratoxina A se comprueba mediante las fórmulas:
donde U y t 2 son el tiempo de retención del pico de ocratoxina A en el primer y segundo cromatograma, respectivamente, min;
I - valor medio aritmético de U y t 2, mín.
Sk: y C «2 - concentraciones másicas de ocratoxina A en la solución de control según el primer y segundo cromatograma, respectivamente, ng/cm 3 ;
C k - media aritmética de los valores de C K: y C yu, ng/cm 3.
La dependencia de la calibración se considera estable si se cumple la condición.
donde C es la concentración másica de ocratoxina A en la solución de control, ng/cm.
Si no se cumple la condición (3), se repite el procedimiento de control. Los resultados del control repetido se consideran definitivos y se vuelve a realizar la calibración del cromatógrafo según 5.3.7.
Nota: normalmente se requiere una calibración repetida del cromatógrafo cuando cambia la eficiencia del sistema cromatográfico o la sensibilidad del detector (por ejemplo, después de reparaciones o un tiempo de inactividad prolongado del cromatógrafo).
5.3.9 Control de la muestra en blanco reactivo
El análisis de una muestra reactiva en blanco se lleva a cabo antes del análisis de las muestras de prueba.
Coloque 30 cm 3 de cloroformo y 2,5 cm 3 de solución de ácido acético según 5.3.2.2 en un matraz de fondo plano con una capacidad de 50 cm 3, mezcle bien y retire con cuidado 20 cm 3 de cloroformo de la capa inferior en un recipiente afilado. -matraz de evaporación de fondo con una capacidad de 50 cm 3, sin permitir que entre agua.
El matraz de fondo afilado se coloca en un evaporador rotatorio y se evapora al vacío hasta obtener un residuo seco a una temperatura de baño de agua de 40 °C a 45 °C. Continúe realizando todas las operaciones de acuerdo con 5.4.3, obteniendo así una muestra concentrada en blanco. Realizar un estudio cromatográfico del concentrado resultante según 5.4.4. Si el cromatograma contiene picos que tienen un tiempo de retención cercano al pico de ocratoxina A, entonces se encuentran y eliminan las causas de la contaminación de la muestra en blanco (reactivos o material de vidrio).
Nota: La razón más común para un resultado de control en blanco insatisfactorio es la pureza insuficiente del cloroformo, que puede estar contaminado con impurezas que tienen tiempos de retención cercanos a los de la ocratoxina A. Dicho cloroformo debe sustituirse o someterse a una destilación cuidadosa, recogiendo la fracción media con un punto de ebullición de 60 ° C a 62 ° C.
5.3.10 Contabilización de las pérdidas de ocratoxina A durante la preparación de la muestra
En un matraz de fondo plano con una capacidad de 50 cm 3, coloque 30 cm 3 de cloroformo (ver 5.2.18) y 2,5 cm 3 de solución de ácido acético (ver 5.3.2.2), agregue 0,25 cm 3 de una solución de ocratoxina. A en acetonitrilo con una concentración másica de 100 ng/cm 3 (ver 5.3.3.2). Mezclar bien y retirar con cuidado 20 cm 3 de la capa de cloroformo (inferior) en un matraz de evaporación de fondo afilado con una capacidad de 50 cm 3, evitando que entre agua. Evaporar hasta obtener un residuo seco al vacío a una temperatura del baño de agua de 40 °C a 45 °C.
A continuación, continúe realizando todas las operaciones de acuerdo con 5.4.3, realice un análisis cromatográfico del concentrado resultante de acuerdo con 5.4.4 y, utilizando la característica de calibración de acuerdo con 5.3.7, calcule la concentración másica de ocratoxina A en el concentrado.
Luego, el coeficiente de transmisión de ocratoxina Ap se calcula utilizando la fórmula
(4)
V 0 - volumen de solución de ocratoxina A según 5.3.3.2, seleccionada para preparar el control
muestra, cm 3 (0,25 cm 3).
El coeficiente de paso de la ocratoxina A se determina al menos tres veces en la etapa de dominio de la técnica y luego al cambiar los lotes de reactivos. Los valores obtenidos deben cumplir los siguientes requisitos:
Cada uno de los valores obtenidos es al menos 0,7;
El valor relativo del rango de los valores obtenidos corresponde a la condición.
I max Umin I q jq ^
donde Dmax yt| min: el mayor y el menor de los valores obtenidos del coeficiente de transmisión de ocratoxina A;
d) - media aritmética de los valores obtenidos del coeficiente de transmisión de ocratoxina
Si se cumplen ambas condiciones, entonces se utiliza el valor medio aritmético del coeficiente de transmisión de ocratoxina A al calcular los resultados de la determinación utilizando la fórmula (9). De lo contrario, encuentre las razones de la pérdida de ocratoxina A y repita la determinación del coeficiente de transmisión.
Notas
1 La razón de un resultado insatisfactorio al determinar el coeficiente de transmisión puede ser una mayor velocidad de paso del eluyente a través de la columna.
2 Se debe prestar especial atención a la necesidad de determinar el coeficiente de paso de la ocratoxina A al cambiar los lotes de gel de sílice. Al cambiar a un nuevo lote de gel de sílice, se recomienda optimizar los volúmenes de eluyentes utilizados para la purificación de muestras en columna (ver 5.4.3), logrando el coeficiente de transmisión más alto. Los volúmenes encontrados en este caso se utilizan al purificar muestras en columnas fabricadas con un lote determinado de reactivo.
3 Se recomienda aclarar el coeficiente de paso de ocratoxina A para matrices específicas utilizando muestras estándar de la composición del producto con un valor certificado de la fracción de masa de ocratoxina A o analizando una muestra "limpia" (no se detecta ocratoxina A en la muestra ) a la que se le ha añadido ocratoxina A. Analizar la muestra estándar (muestra con la adición de ocratoxina A) de acuerdo con 5.4.1 - 5.4.4. Calcule el resultado del análisis (ver 5.5) y encuentre el coeficiente de paso de ocratoxina A como la relación entre el resultado obtenido y el valor certificado de la fracción de masa de ocratoxina A en la muestra estándar o la fracción de masa de ocratoxina A en la aditivo.
5.4 Rendimiento de la prueba
5.4.1 Extracción de ocratoxina A de una muestra
Se coloca una muestra del producto triturado que pesa (5,00 ± 0,01) g en un matraz de fondo plano con una capacidad de 100 cm 3. Añadir 30 cm 3 de cloroformo (ver 5.2.18) y 2,5 cm 3 de solución de ácido acético (ver 5.3.2.2), agitar vigorosamente durante 30 minutos. Pasar el extracto resultante a través de un filtro de papel doblado con cinta roja, seleccionando 20 cm 3 del filtrado para evaporación.
Si no es posible seleccionar 20 cm 3 de filtrado, seleccione el volumen máximo posible, mídalo y utilice el valor resultante en la fórmula (9).
Transferir el filtrado resultante a un matraz de fondo puntiagudo con una capacidad de 50 cm 3 y evaporar hasta obtener un residuo seco al vacío a una temperatura de baño de agua de 40 °C a 45 °C.
El residuo seco se procesa de acuerdo con 5.4.2 o 5.4.3, según el propósito de la prueba: mediante el análisis de muestras o mediante la determinación cuantitativa de la fracción de masa de ocratoxina A en una muestra en la que se detectó un pico identificado como pico de ocratoxina A. detectado durante el cribado.
Nota: cuando se analizan muestras para las cuales hay motivos para creer que están contaminadas con ocratoxina A, se permite proceder directamente a la purificación en columna de acuerdo con 5.4.3, sin pasar por el análisis.
5.4.2 Realización de análisis de muestras
El residuo seco obtenido según 5.4.1 se disuelve en 0,5 cm 3 de la fase móvil según 5.3.2.1 y se agita durante 1 minuto. Luego añadir 3 cm 3 de hexano (ver 5.2.17) y volver a mezclar vigorosamente. Después de la separación de las dos fases inmiscibles, transfiera con cuidado aproximadamente 0,3 cm 3 de la capa inferior a un tubo de micromuestra de un solo uso con una capacidad de 1,5 cm 3 (tubo Eppendorf) o similar.
Registre el cromatograma de la solución resultante de acuerdo con 5.4.4 el día de la prueba. Si se detecta un pico en el cromatograma, identificado por el software del cromatógrafo como un pico de ocratoxina A, repita las pruebas de la muestra, incluida la purificación obligatoria de acuerdo con 5.4.3.
En ausencia de un pico identificado como pico de ocratoxina A, se llega a una conclusión sobre la ausencia de ocratoxina A en la muestra al nivel del límite inferior del rango de medición (0,0025 ppm).
5.4.3 Limpieza de muestras y preparación del concentrado de muestras
El residuo seco según 5.4.1 se disuelve en 1 cm 3 de cloroformo.
Prepare la columna de vidrio según 5.3.4. Deje que el cloroformo drene hasta el nivel de sulfato de sodio anhidro y aplique la solución resultante a la columna. El matraz de fondo afilado en el que se evaporó el extracto se enjuaga dos veces con 1 cm 3 de cloroformo, que también se aplica a la columna. Después de esto, se lava la columna con 10 cm 3 de hexano y se desecha el eluato.
Luego se pasan a través de la columna 30 cm 3 de una mezcla de cloroformo y ácido fórmico (ver 5.3.2.3) a una velocidad de no más de una gota por segundo, eluyendo la ocratoxina A. Todo el eluato se recoge en un matraz puntiagudo y se evapora. hasta sequedad al vacío a una temperatura de baño de agua de 40 °C a 45 °C.
El residuo seco se disuelve en 0,5 cm 3 de la fase móvil (ver 5.3.2.1) y se agita durante 1 minuto. Luego añadir 3 cm 3 de hexano y volver a mezclar vigorosamente. Después de la separación de las dos fases inmiscibles, transfiera con cuidado aproximadamente 0,3 cm 3 de la capa inferior a un tubo de micromuestra de un solo uso con una capacidad de 1,5 cm 3 (tubo Eppendorf) o similar. El concentrado resultante se utiliza para mediciones cromatográficas de acuerdo con 5.4.4 el día de la prueba.
Por ejemplo, la columna Lichrospher® 100 RP 18 es un ejemplo de producto comercial que cumple con estos requisitos. Esta información se proporciona para comodidad de los usuarios de esta norma y no constituye un respaldo del producto especificado.
El pico corresponde a un contenido de ocratoxina A de 0,0042 ppm.
* Un ejemplo de producto comercial que cumple con estos requisitos es una columna cromatográfica con un diámetro interno de 2,1 mm y una longitud de 120 mm, llena con un sorbente de fase inversa Kromasil S-18 con un tamaño de partícula de 5 μm, equipada con una precolumna de 25 mm de largo. Esta información se proporciona para comodidad de los usuarios de esta norma y no constituye un respaldo del producto especificado.
Las ocratoxinas son producidas por algunos tipos de hongos. Aspergilo Y Penicillium. Los principales productores son A.ochraceus Y P. viridicatum. Estos hongos se encuentran en todas partes. Aspergilo produce ocratoxinas a temperaturas y humedad elevadas, y Penicillium ya a 5ºС. Las ocratoxinas son compuestos altamente tóxicos con un efecto teratogénico pronunciado.
Las ocratoxinas A, B y C son un grupo de compuestos estructuralmente similares que son isocomarinas asociadas con l-Enlace peptídico de fenilalanina. Dependiendo de la naturaleza de los radicales se forman varios tipos de ocratoxinas (Tabla 2.3.).
La ocratoxina A es una sustancia cristalina incolora, ligeramente soluble en agua, moderadamente soluble en disolventes orgánicos polares (metanol, cloroformo), así como en una solución acuosa de carbonato de sodio. En su forma químicamente pura es inestable y muy sensible a la luz y al aire, pero en solución de etanol puede permanecer sin cambios durante mucho tiempo. En luz ultravioleta tiene fluorescencia verde.
La ocratoxina B es una sustancia cristalina, análoga a la ocratoxina A, que no contiene un átomo de cloro. Es aproximadamente 50 veces menos tóxico que la ocratoxina A. Tiene una fluorescencia azul con luz ultravioleta.
La ocratoxina C es una sustancia amorfa, el éster etílico de la ocratoxina A, de toxicidad cercana, pero no se ha encontrado como contaminante natural de alimentos y piensos. En U-light tiene una fluorescencia de color verde pálido.
Las ocratoxinas pertenecen a micotoxinas tóxicas, tienen una alta toxicidad para el hígado, los riñones, propiedades teratogénicas e inmunosupresoras y un efecto hemolítico pronunciado. De las ocratoxinas, la más tóxica es la ocratoxina A (LD 50 = 3,4 mg/kg, (pollitos de un día, por vía oral)). Es más tóxico que las aflatoxinas. Otras micotoxinas de este grupo son un orden de magnitud menos tóxicas.
Los mecanismos de acción bioquímicos, moleculares y celulares de las ocratoxinas no se han estudiado suficientemente. Se sabe que la ocratoxina A inhibe la síntesis de proteínas y el metabolismo de los carbohidratos, en particular la gliconogénesis, al inhibir la actividad de la fenilalanina (t-ARN), una enzima específica que desempeña un papel clave en la etapa inicial de la síntesis de proteínas.
La ocratoxina A se encuentra en el maíz, la cebada, el trigo, la avena y la cebada. Un hecho importante y peligroso es que cuando los cereales forrajeros y los piensos están muy contaminados, la ocratoxina A se encuentra en los productos pecuarios (jamón, tocino, salchichas). La ocratoxina B es rara. Las ocratoxinas también afectan a todos los frutos de cultivos hortícolas. Las manzanas se ven especialmente afectadas: hasta el 50% de la cosecha puede estar contaminada con micotoxinas.
Cabe señalar que las ocratoxinas son compuestos estables. Por ejemplo, con el calentamiento prolongado del trigo contaminado con ocratoxina A, su contenido disminuyó sólo un 32% (a una temperatura de 250 a 300ºС). Así, la prevalencia en los alimentos, la toxicidad y la persistencia de las ocratoxinas suponen un peligro real para la salud humana.
Métodos de análisis
La ocratoxina A se encuentra en los alimentos oxidados. Es fácilmente soluble en muchos disolventes orgánicos que se utilizan para la extracción. El más utilizado es la extracción con cloroformo y una solución acuosa de ácido fosfórico, seguida de la purificación en columna y la cuantificación mediante el método TLC.
También se ha desarrollado un método de HPLC. Antes del análisis por HPLC, la muestra se prepara de la siguiente manera. La muestra triturada se trata con una mezcla de ácido clorhídrico 2 M y una solución de cloruro de magnesio 0,4 M. Después de la homogeneización, extraer con tolueno durante 60 minutos. La mezcla se centrifuga. El centrifugado se pasa a través de una columna de gel de sílice y se lava con una mezcla de tolueno y acetona (fase móvil). La ocratoxina A se eluye con una mezcla de tolueno y ácido acético (9:1) y se seca a 40°C. El residuo se disuelve y se filtra. El análisis se lleva a cabo mediante HPLC.
Además, se han desarrollado varios bioensayos con camarones y bacterias, pero los resultados obtenidos no permitieron el uso de estos métodos para la determinación de ocratoxinas.
Concentración de ocratoxina A en la muestra, mg/kg
Límites de error relativos (indicador de precisión) (±d), %, R = 0,95
Desviación estándar de repetibilidad (s r), %
Límite de repetibilidad ( r), %
Integridad de la extracción de sustancias, %
4.2. Equipo auxiliar
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Aparato para agitar muestras tipo AVU-6S o similar |
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Rotavapor IR-1M con trampa o similar |
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Armario eléctrico de secado de laboratorio con error de mantenimiento de temperatura ±2,5 en el rango de 50 a 350 °C |
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refrigerador doméstico |
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Molino eléctrico de laboratorio EM-3A o medidor de pH similar |
TU 46-22-236-79 |
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Agitador magnético tipo MM 5 con varilla agitadora |
TU 25-11.834-80 |
|
Matraces cónicos de fondo plano de 250 cm3 con NSh 29, tipo KnKSh 250-29/32 |
GOST 10394-74 |
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Botellas de vidrio para atornillar de vidrio oscuro (vil), volumen 7 cm3 |
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Matraces aforados de capacidad 100, 500, 1000 cm3 tipo 2-100-2,2-500-2 |
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Embudos de laboratorio |
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Matraces en forma de pera de 10 cm3 con NSh 14,5, tipo GrKSh-10-14/23 |
GOST 10394-72 |
4.3. Reactivos y materiales.
. Preparándose para tomar medidas
5.1. Preparación de soluciones estándar de ocratoxina A.
Para preparar una solución de almacenamiento estándar (la concentración de ocratoxina A es de 10 ng/μl), se colocan una muestra de 5 mg de ocratoxina A cristalina en un matraz volumétrico de 500 cm3, 50 cm3 de una mezcla de ácido tolueno-acético (98:2% vol. ) se agrega, se mezcla bien hasta la completa disolución de la sustancia y se lleva la misma mezcla de solventes a la marca. Para establecer la concentración exacta de la solución de almacenamiento, se mide su densidad óptica a una longitud de onda de 333 nm (D333). La concentración de la solución se calcula mediante la fórmula:
Preparar soluciones de trabajo de ocratoxina A con una concentración de 0,005; 0,05 y 0,1 ng/μl, tomar 50, 500 y 1000 μl de una solución con una concentración de 0,5 ng/μl respectivamente, evaporar hasta sequedad y disolver en 5 cm3 de fase móvil.
La solución de almacenamiento de ocratoxina A se conserva en un recipiente de vidrio con tapón esmerilado en un lugar oscuro y fresco (a una temperatura de aproximadamente 0 °C) durante un máximo de un año y se utiliza para preparar soluciones estándar de trabajo. Las soluciones estándar de trabajo se almacenan en viales de vidrio oscuro en un lugar oscuro y fresco (a una temperatura de aproximadamente 0 °C) durante 1 mes.
Antes de utilizar soluciones estándar de trabajo, se deben llevar a temperatura ambiente y solo entonces se deben abrir las tapas.
5.2. Preparación de solución tampón de fosfato, pH = 7,4
Una muestra de fosfato de sodio disustituido 12-agua que pesa 1,15 g, una muestra de sodio monosustituido 2-agua que pesa 0,124 gy una muestra de cloruro de sodio que pesa 1,74 g se transfieren a un matraz aforado con una capacidad de 100 cm3, agregue 10 - 20 cm3 de agua destilada. Revuelva y ajuste el volumen de solución en el matraz hasta la marca. Vida útil: 1 mes en frigorífico.
5.3. Preparación de mezclas de disolventes.
tolueno-vinagre ácido (98:2 % acerca de.).
Añadir 20 cm3 de ácido acético a un matraz aforado de 1000 cm3 y, agitando, ajustar hasta la marca con tolueno. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
acetonitrilo-agua (60:40 % acerca de.).
Añadir 600 cm3 de acetonitrilo a un matraz aforado de 1000 cm3 y, sin dejar de agitar, añadir agua hasta la marca. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
acetonitrilo-agua (60:40 % acerca de.; pH = 3 ,0 ).
Añadir 600 cm3 de acetonitrilo a un matraz aforado de 1000 cm3 y, agitando, llevar hasta la marca con agua bidestilada. Añadiendo ácido fosfórico, el pH de la mezcla se ajusta a un valor de 3,0. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
Metanol-vinagre ácido (98:2 % acerca de.).
Añadir 20 cm3 de ácido acético a un matraz aforado de 1000 cm3 y, agitando, llevar hasta la marca con metanol. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
. Selección y preparación de muestras para análisis.
6.1. Muestreo
Para tener en cuenta las características específicas del muestreo de ciertos tipos de productos, uno debe guiarse por la documentación técnica y reglamentaria vigente:
"Maíz. Reglas de aceptación y métodos de muestreo" GOST 13586.3-83;
"Sémola. Reglas de aceptación y métodos de muestreo" GOST 26312.1-84;
“Harina y salvado. Métodos de aceptación y muestreo" GOST 27668-88;
“Productos alimenticios enlatados. Muestreo y preparación para la prueba" GOST 8756.0-70.
Las muestras para análisis, representativas de la concentración de micotoxinas para todo el lote, deben tomarse de una muestra promedio (inicial) prehomogeneizada que pese 2 kg.
6.2. Preparación de muestras para análisis.
Las muestras seleccionadas se trituran durante 1 a 2 minutos en un molino de laboratorio. En este caso se utilizan dos muestras paralelas.
6.2.1. Extracción
Se colocan 25 g de muestra triturada en un matraz cónico de fondo plano de 250 cm y se añaden 100 cm3 de una mezcla de acetonitrilo-agua (60:40% vol.). Extraer usando un agitador de muestras durante 30 minutos. La mezcla resultante se filtra a través de un filtro de papel doblado con cinta azul. Tomar 10 cm3 de filtrado y añadir 90 cm de solución tampón fosfato, pH = 7,4.
6.2.2. Purificación de extractos
Se aplican 100 ml de la mezcla resultante a la columna de inmunoafinidad a una velocidad de 1 a 2 gotas por segundo, se lavan con 20 cm3 de solución tampón fosfato, pH = 7,4. La ocratoxina A se eluye con 3 cm3 de una mezcla de metanol-ácido acético (98:2% vol.).
. tomando medidas
7.1. Preparación de la muestra de prueba.
El eluato se evapora hasta sequedad. El residuo seco se disuelve en 400 µl de la fase móvil (solución A).
7.2. Condiciones de cromatografía
Condiciones de HPLC: fase móvil - acetonitrilo-agua (60:40 % vol.; pH = 3,0); velocidad de la fase móvil - 1,5 cm3/min.
El detector fluorimétrico se ajusta a una longitud de onda de radiación excitante de 333 nm y en la línea de emisión se instala un filtro de emisión con una banda de paso de 466 nm.
Para analizar las muestras, se inyectan 50 µl de una muestra de prueba (solución A) en el inyector del cromatógrafo utilizando una microjeringa. Si hay un pico que coincide en el tiempo de retención con la ocratoxina A, la masa de ocratoxina A en la inyección se calcula mediante un gráfico de calibración.
. Procesamiento de resultados de medición
8.1. Construcción de una relación graduada
Para construir una curva de calibración, se realiza un análisis cromatográfico de una serie de soluciones de trabajo de estándares. Se inyectan en el inyector 50 μl de una solución estándar de trabajo con una concentración de 0,005 ng/μl mediante una microjeringa, lo que corresponde a 0,25 ng de ocratoxina A. Se hace lo mismo con otras soluciones estándar con concentraciones de 0,05 y 0,10 ng/μl. , que a su vez corresponde a 2,5 y 5,0 ng de ocratoxina A en la inyección. En estas condiciones, el tiempo de retención de la ocratoxina A está en el intervalo de 4 a 5 minutos. A partir de los datos obtenidos se construye un gráfico de calibración (dependencia del área del pico cromatográfico de la masa de ocratoxina A en la inyección).
El resultado del análisis se presenta en la forma (con probabilidad R = 0,95):
D - límite de error absoluto:
d es el límite del error relativo de la técnica (indicador de precisión), % (Tabla 1).
* 0,0001 mg/kg es el límite de detección.
. Requisitos de calificación del artista intérprete o ejecutante
Las personas con educación superior especial o educación secundaria especializada que dominen las técnicas de análisis HPLC, hayan recibido la capacitación adecuada y tengan experiencia trabajando en un laboratorio químico pueden realizar el análisis de ocratoxina A en cereales y productos de cereales.
. Condiciones de medición
Temperatura ambiente de 15 a 25 °C.
Humedad relativa del aire no más del 80% a 25 °C.
Presión atmosférica 730 - 760 mm Hg.
Tensión de alimentación: 210 - 220 V. Frecuencia CA: 45 - 50 Hz.
Concentración de ocratoxina A en la muestra, mg/kg
Límites de error relativos (indicador de precisión) (±d), %, R = 0,95
Desviación estándar de repetibilidad (s r), %
Límite de repetibilidad ( r), %
Integridad de la extracción de sustancias, %
4. Instrumentos de medida, dispositivos auxiliares, cristalería, reactivos y materiales.
4.1. Instrumentos de medida
4.2. Equipo auxiliar
|
Aparato para agitar muestras tipo AVU-6S o similar |
TU 64-1-2451 |
|
Rotavapor IR-1M con trampa o similar |
TU 25-11917 |
|
Armario eléctrico de secado de laboratorio con error de mantenimiento de temperatura ±2,5 en el rango de 50 a 350 °C |
TU 16-531.639 |
|
refrigerador doméstico |
|
|
Molino eléctrico de laboratorio EM-3A o medidor de pH similar |
TU 46-22-236-79 |
|
Agitador magnético tipo MM 5 con varilla agitadora |
TU 25-11.834-80 |
|
Matraces cónicos de fondo plano de 250 cm 3 con NSh 29, tipo KnKSh 250-29/32 |
GOST 10394-74 |
|
Frascos de vidrio oscuro para atornillar (viles), volumen 7 cm 3 |
|
|
Matraces aforados, capacidad 100, 500, 1000 cm 3 tipo 2-100-2,2-500-2 |
|
|
Embudos de laboratorio |
|
|
Matraces en forma de pera de 10 cm 3 con NSh 14,5, tipo GrKSh-10-14/23 |
GOST 10394-72 |
4.3. Reactivos y materiales.
|
Fosfato de sodio, monosustituido, 2 agua, grado analítico |
|
|
Cloruro de sodio, grado reactivo |
|
|
Acetonitrilo, grado de pureza especial, grado 0 |
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|
Metanol, pureza especial. |
|
|
Ácido fosfórico, pureza especial. |
TU 2612-014-00203677-97 |
|
Ácido acético glacial, grado reactivo |
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|
Tolueno, grado analítico |
|
|
Columnas de inmunoafinidad Ochraprep (R-Biopharm, Reino Unido) |
. Preparándose para tomar medidas
5.1. Preparación de soluciones estándar de ocratoxina A.
Para preparar una solución de almacenamiento estándar (concentración de ocratoxina A - 10 ng/μl), se colocan una muestra de 5 mg de ocratoxina A cristalina en un matraz volumétrico de 500 cm 3, 50 cm 3 de una mezcla de ácido tolueno-acético (98:2% vol.), agitar con cuidado hasta que la sustancia se disuelva por completo y diluir con la misma mezcla de disolventes hasta la marca. Para establecer la concentración exacta de la solución de almacenamiento, se mide su densidad óptica a una longitud de onda de 333 nm (D 333). La concentración de la solución se calcula mediante la fórmula:
A continuación, se diluyen 5 cm 3 de una solución estándar de ocratoxina A con una concentración de 10 ng/μl con una mezcla de ácido tolueno-acético (98:2 % vol.) hasta un volumen de 100 cm 3, obteniéndose una solución de trabajo. con una concentración de 0,5 ng/μl.
Preparar soluciones de trabajo de ocratoxina A con una concentración de 0,005; 0,05 y 0,1 ng/μl, tomar 50, 500 y 1000 μl de una solución con una concentración de 0,5 ng/μl respectivamente, evaporar hasta sequedad y disolver en 5 cm 3 de fase móvil.
La solución de almacenamiento de ocratoxina A se conserva en un recipiente de vidrio con tapón esmerilado en un lugar oscuro y fresco (a una temperatura de aproximadamente 0 °C) durante un máximo de un año y se utiliza para preparar soluciones estándar de trabajo. Las soluciones estándar de trabajo se almacenan en viales de vidrio oscuro en un lugar oscuro y fresco (a una temperatura de aproximadamente 0 °C) durante 1 mes.
Antes de utilizar soluciones estándar de trabajo, se deben llevar a temperatura ambiente y solo entonces se deben abrir las tapas.
5.2. Preparación de solución tampón de fosfato, pH = 7,4
Una muestra de fosfato de sodio disustituido 12-agua que pesa 1,15 g, una muestra de sodio monosustituido 2-agua que pesa 0,124 gy una muestra de cloruro de sodio que pesa 1,74 g se transfieren a un matraz aforado con una capacidad de 100 cm 3, se agregan 10 - 20 cm 3 de agua destilada. Revuelva y ajuste el volumen de solución en el matraz hasta la marca. Vida útil: 1 mes en frigorífico.
5.3. Preparación de mezclas de disolventes.
tolueno-vinagre ácido (98:2 % acerca de.).
Añadir 20 cm 3 de ácido acético a un matraz aforado de 1000 cm 3 y, agitando, ajustar hasta la marca con tolueno. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
acetonitrilo-agua (60:40 % acerca de.).
Añadir 600 cm 3 de acetonitrilo a un matraz aforado de 1000 cm 3 y, agitando, llevar hasta la marca con agua. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
acetonitrilo-agua (60:40 % acerca de.; pH = 3 ,0 ).
Añadir 600 cm 3 de acetonitrilo a un matraz aforado de 1000 cm 3 y, agitando, llevar hasta la marca con agua bidestilada. Añadiendo ácido fosfórico, el pH de la mezcla se ajusta a un valor de 3,0. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
Metanol-vinagre ácido (98:2 % acerca de.).
Añadir 20 cm 3 de ácido acético a un matraz aforado de 1000 cm 3 y, agitando, llevar hasta la marca con metanol. Vida útil: 1 mes en un lugar fresco y oscuro.
. Selección y preparación de muestras para análisis.
6.1. Muestreo
Para tener en cuenta las características específicas del muestreo de ciertos tipos de productos, debe guiarse por la documentación técnica y reglamentaria vigente:
"Maíz. Reglas de aceptación y métodos de muestreo" GOST 13586.3-83;
"Sémola. Reglas de aceptación y métodos de muestreo" GOST 26312.1-84;
“Harina y salvado. Métodos de aceptación y muestreo" GOST 27668-88;
“Productos alimenticios enlatados. Muestreo y preparación para la prueba" GOST 8756.0-70.
Las muestras para análisis, representativas de la concentración de micotoxinas para todo el lote, deben tomarse de una muestra promedio (inicial) prehomogeneizada que pese 2 kg.
6.2. Preparación de muestras para análisis.
Las muestras seleccionadas se trituran durante 1 a 2 minutos en un molino de laboratorio. En este caso se utilizan dos muestras paralelas.
6.2.1. Extracción
Se colocan 25 g de muestra triturada en un matraz cónico de fondo plano de 250 cm y se añaden 100 cm 3 de una mezcla de acetonitrilo-agua (60:40 % vol.). Extraer usando un agitador de muestras durante 30 minutos. La mezcla resultante se filtra a través de un filtro de papel doblado con cinta azul. Se toman 10 cm 3 de filtrado y se añaden 90 cm de solución tampón fosfato, pH = 7,4.
6.2.2. Purificación de extractos
Se aplican 100 ml de la mezcla resultante a la columna de inmunoafinidad a una velocidad de 1 a 2 gotas por segundo, se lavan con 20 cm 3 de solución tampón fosfato, pH = 7,4. La ocratoxina A se eluye con 3 cm 3 de una mezcla de metanol-ácido acético (98:2% vol.).
. tomando medidas
7.1. Preparación de la muestra de prueba.
El eluato se evapora hasta sequedad. El residuo seco se disuelve en 400 µl de la fase móvil (solución A).
7.2. Condiciones de cromatografía
Condiciones de HPLC: fase móvil - acetonitrilo-agua (60:40 % vol.; pH = 3,0); velocidad de la fase móvil - 1,5 cm 3 /min.
El detector fluorimétrico se ajusta a una longitud de onda de radiación excitante de 333 nm y en la línea de emisión se instala un filtro de emisión con una banda de paso de 466 nm.
Para analizar las muestras, se inyectan 50 µl de una muestra de prueba (solución A) en el inyector del cromatógrafo utilizando una microjeringa. Si hay un pico que coincide en el tiempo de retención con la ocratoxina A, la masa de ocratoxina A en la inyección se calcula mediante un gráfico de calibración.
. Procesamiento de resultados de medición
8.1. Construcción de una relación graduada
Para construir una curva de calibración, se realiza un análisis cromatográfico de una serie de soluciones de trabajo de estándares. Se inyectan en el inyector 50 µl de una solución estándar de trabajo con una concentración de 0,005 ng/μl mediante una microjeringa, lo que corresponde a 0,25 ng de ocratoxina A. Se hace lo mismo con otras soluciones estándar con concentraciones de 0,05 y 0,10 ng/μl. , que a su vez corresponde a 2,5 y 5,0 ng de ocratoxina A en la inyección. En estas condiciones, el tiempo de retención de la ocratoxina A está en el intervalo de 4 a 5 minutos. A partir de los datos obtenidos se construye un gráfico de calibración (dependencia del área del pico cromatográfico de la masa de ocratoxina A en la inyección).
8.2. Registro de resultados
La concentración de ocratoxina A en la muestra se calcula mediante la fórmula:
C (guardia A)- concentración de ocratoxina A en la muestra, mg/kg;
METRO- masa de muestra para análisis, g (25,0);
t- masa de ocratoxina A correspondiente al volumen de solución A introducida en el cromatógrafo, ng;
V 1 - volumen de solución para extracción, cm 3 (100);
D - límite de error absoluto:
d - límite del error relativo del método (indicador de precisión), % (Tabla 1).
Si el contenido de ocratoxina A en la muestra es inferior al límite inferior del rango de concentraciones determinadas, el resultado del análisis se presenta como:
* 0,0001 mg/kg es el límite de detección.
8.3. Comprobación de la aceptabilidad de los resultados de determinaciones paralelas
Discrepancia permitida entre mediciones paralelas (R) se determinan en función del límite de repetibilidad (r) (Tabla 1):
R = 0,01 (r, %) × , mg/kg
Si la discrepancia entre definiciones paralelas no excede el límite permitido:
luego se toma la media aritmética como resultado del análisis.
Si se excede el estándarRLas mediciones deben repetirse utilizando muestras de reserva.
. Control de calidad de los resultados de las mediciones.
La frecuencia del seguimiento de los errores de medición depende del número de mediciones de trabajo durante el período controlado y está determinada por los planes de control.
Las muestras de control son muestras de trabajo de materias primas alimentarias y productos alimenticios. Toma una muestra y divídela en 2 partes iguales. Uno de ellos se deja sin cambios y al otro se le agrega una cantidad tal de solución estándar de ocratoxina que su fracción de masa en la muestra aumenta entre un 50 y un 100% en comparación con el valor inicial. El aditivo debe introducirse en la muestra antes de que comience la preparación de la muestra.
Ambas muestras se analizan estrictamente de acuerdo con las instrucciones metodológicas y se obtienen los resultados del análisis de la muestra original ( C (negativo A)) y muestras con aditivo ( CON ¢ (negativo A)). La determinación se realiza en las mismas condiciones, es decir: el análisis lo realiza un solo analista, utilizando un juego de material de vidrio volumétrico, reactivos, soluciones, etc.
El algoritmo para realizar el control de errores operacionales utilizando el método aditivo consiste en comparar el resultado de una determinación de control igual a la diferencia entre el resultado de una medición de control de una muestra con un aditivo ( CON
¢
(ocre)), muestras sin aditivos ( C (guardia A)) y la cantidad de aditivo ( Con ext(guardia A)) con estándares de control operativo (k). La decisión sobre un error satisfactorio se toma cuando se cumple la siguiente condición (si R y Temperatura ambiente de 15 a 25 °C. Humedad relativa del aire no más del 80% a 25 °C. Presión atmosférica 730 - 760 mm Hg. Tensión de alimentación: 210 - 220 V. Frecuencia CA: 45 - 50 Hz.