El método consiste en introducir en un ordenador una imagen con objetos parecidos a los cometas, los “cometas”, que son un conjunto de puntos fluorescentes fusionados y separados de diferente brillo, a partir de una muestra biológica instalada en un microscopio fluorescente con una cámara de vídeo. Luego buscan estos "cometas" en la imagen, resaltan su contorno con la definición del límite de la "cabeza" y la "cola" y realizan morfometría microscópica. Antes de buscar "cometas" en una imagen, se optimizan los niveles de brillo de la imagen y se realiza un filtrado de paso bajo para combinar puntos de "cometas" individuales en áreas borrosas. Luego, la imagen resultante se segmenta en función del umbral de brillo, definido como el desplazamiento del fondo, los contornos de los "cometas" se encuentran llenando un área limitada "con una semilla", donde la semilla es un punto arbitrario que pertenece al “cometa”, se encuentra el centro de la cabeza de cada “cometa”, determinando el centro de gravedad de los puntos con intensidad de luminiscencia cercana al máximo. La determinación del límite virtual de la “cabeza” y la “cola” se lleva a cabo reflejando la distribución de intensidades de luminiscencia de los puntos en la parte frontal de la cabeza del cometa, luego se realiza la morfometría microscópica de los “cometas” midiendo: la longitud del “cometa”, la “cola” y el diámetro de la “cabeza”. Luego se calcula el porcentaje de ADN en todo el “cometa”, en la “cola” y las medidas de daño en el ADN. Las operaciones enumeradas se llevan a cabo automáticamente, simultáneamente en todos los "cometas" en una serie de imágenes. El resultado técnico es aumentar la precisión y la velocidad de procesamiento y análisis de imágenes de “cometas”.
Un método para procesar y analizar imágenes de objetos similares a cometas obtenidas mediante el método "ADN de cometa" (ensayo de cometa o electroforesis en gel unicelular - SCGE) en preparaciones biológicas pertenece al campo del procesamiento y análisis de imágenes de objetos - "cometas", y está destinado a la informatización (automatización) de los procesos de investigación morfométrica en el campo de la biomedicina, realizados para determinar el grado de daño a las moléculas de ADN causado por diversos agentes ambientales, para estudiar la reparación de las moléculas de ADN a nivel de células individuales, para evaluar la integridad integral del genoma, determinar la radiosensibilidad individual de pacientes con cáncer sometidos a radioterapia, para la bioindicación de aguas marinas costeras, en otras palabras, para monitorear una amplia gama de daños en el ADN causados por factores ambientales mutagénicos.
Las imágenes de "cometas" son un conjunto de puntos fluorescentes fusionados y separados de diferente brillo, obtenidos mediante electroforesis en gel de células individuales lisadas (el método del "ADN del cometa"), por lo que no es posible procesarlas y analizarlas de la manera prevista para las imágenes. de objetos ordinarios (sólidos).
Actualmente, las imágenes de “cometas de ADN” se analizan ya sea mediante observación visual bajo un microscopio de fluorescencia y diferenciándolas según el grado de daño del ADN, o mediante herramientas informáticas de procesamiento de imágenes.
Mediante análisis visual (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photo comet assay - Un ensayo de detección rápida para la determinación de la fotogenotoxicidad in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis. 2007, 632 ( 1-2), p.44-57) Los “cometas de ADN” se clasifican en cinco tipos condicionales con un valor numérico correspondiente de 0 a 4. El grado de daño en el ADN se expresa como el índice de “cometa de ADN” (Y ADN), determinado por la fórmula
Y ADN =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,
donde n 0 -n 4 es el número de “cometas de ADN” de cada tipo, es la suma de los “cometas de ADN” contados.
Este método de procesamiento y análisis es muy laborioso, subjetivo, tiene sólo cinco niveles de gradación de diferenciación de los “cometas de ADN” y, por lo tanto, tiene baja precisión y, por lo tanto, baja confiabilidad de los resultados.
Lo más cercano a lo propuesto solución técnica es un método de análisis informático de imágenes de “cometas de ADN”, implementado en el software SCGE-Pro (ver Chaubery R.C. Computerized Image Analysis software for the comet assay. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106), adoptado como prototipo. . Este método de análisis de "cometas" requiere menos mano de obra y es especialmente necesario para una evaluación objetiva de sus parámetros (por ejemplo, la longitud del "cometa", la longitud de la "cola", el diámetro de la "cabeza" , el porcentaje de ADN en la “cabeza” o en la “cola”, etc.), que se utilizan como indicadores que caracterizan el nivel de daño del ADN en las células estudiadas. El método permite encontrar "cometas" en la imagen y calcular sus parámetros de forma manual y automática.
La desventaja de este método conocido es el método de determinar los límites de un "cometa" utilizando un área rectangular, lo que reduce la precisión del cálculo de los parámetros necesarios para evaluar el daño del ADN (especialmente si el daño es débilmente expresado), ya que en este caso La interferencia localizada cerca también puede atribuirse al cometa. Además, con este método de análisis, el límite de la “cabeza” y la “cola” se define como una línea recta, perpendicular al eje del “cometa” y que divide el cometa en “cabeza” y “cola”, que reduce en gran medida la precisión del cálculo de la longitud de la "cola del cometa" y el porcentaje de contenido de ADN en la "cabeza" y en la "cola".
El resultado técnico de la invención es aumentar la precisión y la velocidad de procesamiento y análisis de imágenes de "cometas" obtenidas mediante el método "ADN-cometas", incluido el filtrado, la segmentación de "cometas", la asignación de sus contornos y la determinación de los límites de la “cabeza” y la “cola”, lo que permite aumentar la confiabilidad de los resultados de la morfometría microscópica, necesaria para la informatización de los procesos de investigación biométrica que se llevan a cabo para monitorear una amplia gama de daños en el ADN causados por diversos factores ambientales mutagénicos.
El resultado técnico se logra mediante el hecho de que el método de procesamiento y análisis de imágenes de objetos similares a cometas obtenidos mediante el método "ADN-cometas", que consiste en el hecho de que se ingresa una imagen con objetos similares a cometas - "cometas" en la computadora desde una muestra biológica instalada en un microscopio fluorescente con una cámara de video, que representa un conjunto de puntos fluorescentes fusionados y separados de diferente brillo, busque estos "cometas" en la imagen, resalte su contorno con la determinación del borde del "cabeza" y "cola", realice morfometría microscópica y, antes de buscar "cometas" en la imagen, realice optimización del nivel brillo de la imagen y filtrado de baja frecuencia para combinar puntos individuales de los "cometas" en áreas borrosas , luego segmente la imagen resultante según el umbral de brillo, definido como el desplazamiento del fondo, encontrando los contornos de los "cometas" llenando un área limitada "con una semilla", encontrando la "cabeza" central de cada "cometa" , determinando el centro de gravedad de los puntos con una intensidad de luminiscencia cercana al máximo, determinando el límite virtual de la "cabeza" y la "cola", reflejando la distribución de intensidades de luminiscencia de los puntos en la parte frontal del "cometa cabeza", luego realizando morfometría microscópica " cometas", midiendo: la longitud del "cometa", "cola", el diámetro de la "cabeza" y calculando el porcentaje de ADN en todo el "cometa", "en la cola ", medidas de daño al ADN y muchos otros parámetros que caracterizan el grado de daño al ADN dependiendo del problema que se resuelva, y las operaciones enumeradas se llevan a cabo de forma automática, simultáneamente en todos los “cometas” de la imagen o serie de imágenes.
El método se lleva a cabo realizando una secuencia de los siguientes procedimientos:
1. Ingresar a una computadora desde una muestra biológica instalada en un microscopio fluorescente con una cámara de video, imágenes con objetos similares a cometas: "cometas", que son un conjunto de puntos fluorescentes fusionados y separados de diferente brillo.
2. Optimice los niveles de brillo de la imagen. El brillo cero es el fondo, el brillo máximo es el centro de la cabeza del “cometa”.
3. Se realiza un filtrado gaussiano de paso bajo (desenfoque) con un radio grande igual a 1/10 del radio del "cometa" promedio para combinar puntos individuales de los "cometas" en áreas borrosas. Para evitar que los cometas ubicados cerca unos de otros se fusionen, los ajustes del radio de desenfoque se utilizan de forma interactiva.
4. La segmentación de las regiones borrosas resultantes se realiza en función del umbral de brillo. El umbral se determina automáticamente como un desplazamiento del fondo (no hay inclusiones u objetos extraños que no sean "cometas" en la imagen), pero el umbral se puede ajustar de forma interactiva.
5. Encontrar los contornos de los “cometas” llenando un área limitada “con una semilla”, donde la semilla se entiende como un punto arbitrario perteneciente al “cometa”.
Encontrar el centro de la “cabeza de cometa”. Se pueden utilizar dos métodos para determinarlo: por la distribución máxima de la intensidad del brillo de los puntos del "cometa" a lo largo del eje horizontal o por el centro de gravedad de los puntos con una intensidad del brillo superior al 80% del máximo.
Determinación del límite virtual de la “cabeza” y la “cola” reflejando la distribución de intensidades de luminiscencia de los puntos en la parte frontal de la “cabeza del cometa” (la parte frontal es la parte que llega hasta el límite frontal del “cometa”) cabeza").
Realizar morfometría microscópica de “cometas” midiendo: la longitud del “cometa”, la longitud de la “cola”, el diámetro de la “cabeza” y calculando el porcentaje de ADN en todo el “cometa”, “en la cola ”, medidas de daño al ADN y muchos otros parámetros que caracterizan el grado de daño al ADN dependiendo del problema que se esté resolviendo.
9. Los valores de los parámetros obtenidos de cada cometa se envían a una tabla de MS EXCEL para implementar la tarea del usuario, por ejemplo, para análisis estadísticos adicionales o clasificación de "cometas" según el grado de daño a la estructura del ADN.
Así, en el método propuesto, cada área del cometa está determinada por su contorno complejo, lo que aumenta la precisión del cálculo de los parámetros, a diferencia del método conocido, donde los límites de los "cometas" se determinan mediante un rectángulo. área, lo que reduce la precisión del cálculo de los parámetros necesarios para evaluar el daño (especialmente si el daño es débilmente expresado) "cometas de ADN", ya que en este caso la interferencia ubicada cerca también puede clasificarse como un "cometa". Además, en el método conocido, el límite de la "cabeza" y la "cola" se define como una línea recta, perpendicular al eje del cometa y que divide el cometa en "cabeza" y "cola". El método propuesto utiliza un límite virtual, determinado calculando el centro de la "cabeza del cometa" y reflejando la distribución de la intensidad del brillo de los puntos en la parte frontal de la "cabeza del cometa". Esto aumenta significativamente la precisión del cálculo de la longitud de la cola del cometa y el porcentaje de ADN en la "cabeza y cola".
Cabe señalar que todas las operaciones anteriores se realizan automáticamente y simultáneamente en todos los "cometas" de una imagen o serie de imágenes.
FÓRMULA DE LA INVENCIÓN
Un método para procesar y analizar imágenes de objetos similares a cometas obtenidas mediante el método "ADN-cometas", que consiste en introducir en una imagen objetos similares a cometas - "cometas", que son un conjunto de puntos fluorescentes fusionados y separados de diferentes brillo, buscar estos “cometas” en la imagen, resaltar su contorno con determinación del borde de la “cabeza” y la “cola”, realizar morfometría microscópica, caracterizada porque antes de buscar “cometas” en la imagen, optimización de niveles de brillo de la imagen y filtrado de baja frecuencia para combinar puntos individuales de "cometas" en áreas borrosas, luego la segmentación de la imagen resultante se realiza en función de un umbral de brillo, definido como un desplazamiento del fondo, encontrando los contornos de los "cometas". ” llenando un área limitada “con una semilla”, donde una semilla es un punto arbitrario, perteneciente al “cometa”, encontrando el centro de la cabeza de cada “cometa” determinando el centro de gravedad de los puntos con una intensidad de brillo cerca del máximo, determinando el límite virtual de la “cabeza” y la “cola” reflejando la distribución de las intensidades de brillo de los puntos en la parte frontal de la cabeza del cometa, luego realizando una morfometría microscópica de los “cometas” midiendo la longitud del “cometa”, “cola”, diámetro de la “cabeza” y calculando el porcentaje de ADN en todo el “cometa”, en la “cola” y una medida del daño del ADN, y las operaciones anteriores se realizan de forma automática, simultáneamente en todos los “cometas”” en una serie de imágenes.
1Se realizó un estudio de indicadores de fragmentación del ADN utilizando el método del cometa del ADN en modificación alcalina en condiciones diferentes niveles exposición a factores de radiación en condiciones domésticas. Se tuvieron en cuenta la actividad volumétrica (VA) del radón, la tasa de dosis ambiental equivalente (AEDR) de la radiación gamma y la densidad de flujo de la radiación beta. El valor promedio de radón OA en el aire interior fue de 89,4 Bq/m3, el valor MAED de fondo gamma fue de 0,12 μSv/h y la densidad de flujo de radiación beta fue de 0,6 s-1. El nivel medio de fragmentación del ADN fue del 3,48%. El nivel de fragmentación del ADN según 3 indicadores (proporción de ADN en la cola del cometa, longitud de la cola del cometa, momento de la cola del cometa) aumentó en los hombres, pero esta tendencia no alcanzó significación estadística. Las puntuaciones del ADN de los cometas no difirieron significativamente en función de los cambios en los niveles de radón. Se descubrió una correlación positiva entre los indicadores del ADN de los cometas y un aumento en el poder de la radiación gamma. Al mismo tiempo, la DER de la radiación gamma se encontraba dentro de límites aceptables en todas las instalaciones examinadas.
radiación ionizante
cometas de adn
Modificación alcalina de cometas de ADN.
efectos de bajas dosis de radiación
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Los efectos del radón han sido bien estudiados en el rango de alta concentración. Las normas de higiene establecidas establecen un nivel de actividad volumétrica de equilibrio equivalente (ERVA) de 200 Bq/m3 como límite de actividad volumétrica permisible del radón en el aire de las viviendas. Al mismo tiempo, en varios países el nivel permitido se ha aumentado a 400 Bq/m3, lo que se explica, en primer lugar, por las características geológicas del territorio. Por otro lado, existe un punto de vista sobre la necesidad de reducir nivel permitido hasta 2 pCu/l, lo que corresponde a 74 Bq/m3. En el marco del paradigma moderno de la OMS y el principio de un aumento lineal y sin umbral de los efectos de la radiación, incluso una pequeña exposición a la radiación conduce a un aumento del riesgo de efectos estocásticos (principalmente cáncer).
Está claro que los pequeños efectos de la radiación que afectan grupos grandes personas puede provocar un aumento socialmente significativo de la incidencia del cáncer. Por ello, parece sumamente relevante acumular información sobre los efectos de varios tipos de radiaciones ionizantes en pequeñas dosis, a las que está expuesta en un grado u otro toda la población del planeta. La mayoría de las normas aceptadas en el campo de la higiene radiológica consideran indeseable un aumento del contenido de energía del radón por encima de 200 Bq/m3. Al mismo tiempo, solo entre el 5 y el 10% de las viviendas pueden clasificarse como locales con este nivel de exposición. Se puede observar un nivel de actividad volumétrica (VA) del radón de 2 pCiu/l (74 Bq/m3) y superior en el 20-50% de los locales residenciales, dependiendo del tipo de edificio y la ubicación geográfica. Es obvio que incluso una exposición de baja intensidad al radón puede provocar un aumento significativo de la morbilidad, dada la escala global del problema. parece investigación actual Influencia de bajas dosis de radiación densamente ionizante en el cuerpo humano.
Actualmente, el radón está reconocido como uno de los carcinógenos más peligrosos que afectan a los seres humanos. En la naturaleza, el factor de radiación radón no juega un papel importante, ya que el gas radón se dispersa en un gran volumen de aire y se desintegra con bastante rapidez (vida media del Rn222 = 3,82 días). Al mismo tiempo, los edificios residenciales y técnicos son una especie de trampas que acumulan radón (hasta 10 veces más que al aire libre). Los focos de emisión de radón suelen localizarse esporádicamente y se considera que el radón es la causa principal del aumento de la frecuencia de aberraciones cromosómicas en grupos expuestos similares.
Uno de los métodos eficaces de biomonitoreo es la evaluación directa del grado de daño del ADN en las células sanguíneas mediante el método del “ADN cometa” (electroforesis en gel de células individuales). este método Implica la lisis de células colocadas en un gel de agarosa, mientras el ADN migra en un campo eléctrico. Las células con una mayor frecuencia de roturas dobles se caracterizan por una mayor migración de ADN hacia el ánodo. En 1988, el trabajo de Singh y sus colegas propusieron una modificación alcalina del método, incluyendo un paso de lisis a pH>13. Esta versión aumenta significativamente la sensibilidad del método, permitiendo la detección de roturas individuales, sitios álcali-lábiles, enlaces cruzados ADN-ADN y ADN-proteína, así como sitios de reparación incompleta. Dado que en la mayoría de los genotóxicos predominan los efectos de roturas únicas del ADN, una modificación alcalina del método permitió aumentar significativamente el contenido de información y la sensibilidad de la prueba. Una de las principales ventajas es la capacidad de identificar efectos genotóxicos en condiciones de acción simultánea de factores citotóxicos que conducen a la formación de anomalías cromosómicas, pero que no tienen un efecto genotóxico. En condiciones de pH>12, el ADN se desnaturaliza y las hebras se desenredan debido a la destrucción de los enlaces de hidrógeno entre las 2 hélices. Cuando el pH alcanza 12,6, los sitios álcali-lábiles, como los sitios apurínicos/apirimidínicos, se transforman en roturas únicas del ADN. A pH>13 se alcanza el grado máximo de transformación de los sitios álcali-lábiles.
Materiales y métodos
Características de la muestra
Cada persona examinada llenó un cuestionario personal, que incluía información sobre edad, estado de salud, consumo de tabaco y alcohol, riesgos laborales, procedimientos de diagnóstico por rayos X, viajes aéreos, vacunas y citas. medicamentos durante los 3 meses anteriores al examen. Se seleccionó un grupo de 39 sujetos que no estuvieron expuestos a factores potencialmente genotóxicos. Todos los examinados no tenían más de 40 años. Un total de 18 hombres fueron examinados ( mediana edad 29 años) y 21 mujeres (edad promedio 31 años).
El estudio se llevó a cabo de acuerdo con los requisitos de la Comisión de Ética de la Universidad Estatal de Kemerovo, el protocolo del estudio fue aprobado en la reunión de la Comisión No. 4 el 10 de octubre de 2016. Cada participante firmó un formulario de consentimiento informado que contiene información sobre el propósitos del estudio.
Muestras de biomateriales
Se recogieron muestras de sangre venosa en tubos de vacío de 4 ml que contenían EDTA sódico como anticoagulante. La recogida del material se realizó entre noviembre de 2016 y abril de 2017. En 1 o 2 horas las muestras fueron transportadas al laboratorio. Todas las muestras fueron codificadas y procesadas. El método del ADN del cometa comenzó inmediatamente después de recibir las muestras.
Electroforesis en gel de células individuales (método del ADN cometa)
El método del ADN cometa se realizó en una modificación alcalina desarrollada por Singh et al. La primera capa del gel fue una solución al 1% de agarosa estándar (Applichem, EE. UU.). Para recubrir las células, se usó agarosa al 1% con un punto de fusión bajo (agarosa de bajo punto de fusión, Applichem, EE. UU.) a 39 °C. Se añadieron 70 µl de una suspensión de células sanguíneas en agarosa de bajo punto de fusión a un vaso con agarosa estándar y se colocaron en hielo hasta que el gel se endureciera por completo. Después de la solidificación, los portaobjetos se colocaron en tampón de lisis a 4°C durante 12 horas. Composición del tampón de lisis: 2,5 mol/l NaCl (Vekton, Rusia), 0,1 mol/l Na2EDTA (Vekton, Rusia), 1% Triton X-100 (Amresco, EE.UU.), 10% DMSO ("Vecton", Rusia) . Después de la lisis, se llevó a cabo una electroforesis horizontal (300 mA, 25 V, 30 min) en un tampón alcalino (pH>13). La electroforesis fue precedida por 20 min. tratamiento con tampón alcalino (NaOH 300 mM (Vekton, Rusia), Na2EDTA 1 mM (Vekton, Rusia). La lisis y electroforesis se llevaron a cabo a 4 °C en ausencia de luz solar directa. Después de la electroforesis, los vidrios se neutralizaron tres veces en PBS salino tamponado con fosfato, pH 7,5 (Amresco, EE. UU.). Después de esto, los portaobjetos se trataron con etanol al 70% durante 5 minutos. Las preparaciones se secaron y se tiñeron con 50 µl de dosis única de SYBR GREEN (Biotech-Industry, Rusia).
Análisis de cometas
Los parámetros de fragmentación se evaluaron mediante microfotografía de preparaciones teñidas con SYBR GREEN utilizando un microscopio Zeiss Axio Imager 2. Se fotografiaron un total de 100 cometas seleccionados al azar de cada muestra estudiada con un aumento de x400. El procesamiento posterior de las fotografías se realizó utilizando el paquete de software CASP. Se calcularon los parámetros de la longitud de la cola del cometa, el momento de la cola y la fracción de ADN en la cola del cometa.
Métodos estadísticos
El análisis de datos estadísticos se realizó utilizando el paquete Statistica 10.0. Para los indicadores cuantitativos se calcularon las medias y los límites del intervalo de confianza del 95% (IC 95). Las comparaciones de grupos se realizaron mediante la prueba U de Mann-Whitney. El nivel de significancia se tomó en el nivel del 5%. Las correlaciones entre puntuaciones para datos no paramétricos se calcularon utilizando el coeficiente de correlación de Pearson para rangos. Al mismo tiempo, para muestras de más de 50 personas, también se calculó el valor del test de Student, a partir del valor del coeficiente de correlación de Pearson.
Resultados
La proporción de ADN en la cola del cometa no superó el 15%. La actividad de volumen promedio (VA) del radón en el aire interior fue de 89,4 Bq/m3, el fondo gamma DER fue de 0,12 μSv/h y la densidad de flujo de radiación beta fue de 0,6 s-1. El nivel de fragmentación del ADN según 3 indicadores aumentó en los hombres, pero esta tendencia no alcanzó significación estadística (Tabla 1).
Tabla 1
Indicadores de fragmentación del ADN en los hombres y mujeres examinados.
Como nivel límite de radón OA en el aire se eligió el nivel de 74 Bq/m3, correspondiente a 2 pCiu/l de aire. La RA media del radón fue de 47 Bq/m3 en el primer grupo y de 143 Bq/m3 en el segundo grupo. El mayor contenido de información se estableció para el indicador del momento de cola de los cometas. El momento de cola aumentó en el grupo con niveles más altos de radón, pero esta tendencia no alcanzó el nivel de significación estadística (Tabla 2). Esta tendencia es típica sólo de los hombres encuestados.
Tabla 2
Indicadores de fragmentación del ADN en grupos diferenciados por sexo y radón OA
|
Radón OA en el aire interior, Bq/m3 |
% ADN en cola de cometa |
Longitud de la cola, µm |
Momento de la cola del cometa |
|
|
3,65 |
13,73 |
0,94 |
||
|
3,97 |
14,52 |
1,43 |
||
|
3,30 |
13,21 |
0,88 |
||
|
3,00 |
11,95 |
0,72 |
||
|
3,43 |
13,42 |
0,90 |
||
|
3,51 |
13,30 |
1,09 |
||
También se investigó la posible dependencia de los indicadores de ADN de la magnitud de la radiación gamma DER en locales residenciales. Para la verificación, se calculó el coeficiente de correlación entre los indicadores de daño al ADN y la radiación gamma DER. Se encontró una correlación positiva entre los indicadores del ADN del cometa y un aumento en el poder de la radiación gamma (Figura). Al mismo tiempo, la DER de la radiación gamma se encontraba dentro de límites aceptables en todas las instalaciones examinadas.
Dependencia de los indicadores de fragmentación del ADN de la radiación gamma DER en locales residenciales (r - coeficiente de correlación de Spearman, p - probabilidad de la hipótesis "nula")
Discusión
Exposición a la radiación
La radiación ionizante puede inducir la formación de grupos de daños en el ADN, que se producen en forma de roturas de doble cadena y otros daños localizados de forma compacta. Las radiaciones ionizantes raras y densas causan aproximadamente el mismo número de lesiones individuales en el ADN por unidad de dosis absorbida, pero en el caso de la radiación ionizante densa (partículas alfa), estas lesiones se distribuyen en menos sitios del ADN, lo que implica un aumento en el número de lesiones en un grupo; por ejemplo, el número promedio de daños en un grupo tiende a aumentar con la transferencia lineal de energía. La radiación gamma registrada en los lugares de residencia de todos los examinados no supera los valores de fondo regulados. Los cambios en el fondo gamma probablemente fueron causados por las características de los edificios y los materiales de construcción.
Análisis de cometas
El método DNA Comet es una prueba sencilla y rápida que mide eficazmente el nivel de daño del ADN y la reparación del daño después de la exposición. En este estudio, no se encontró heterogeneidad significativa con respecto al nivel de daño del ADN en la población de estudio. Varios trabajos dedicados a la dosimetría biológica señalaron anteriormente las dificultades para identificar el efecto de bajas dosis de radiación. Al mismo tiempo, la mayoría de los estudios examinaron grupos de personas irradiadas por una fuente artificial externa, por ejemplo, personal de instalaciones radiológicas y de rayos X.
Las mediciones de las tasas de fragmentación del ADN pueden reflejar tanto el nivel de daño del ADN de un individuo como la capacidad de reparar el daño por radiación. Anteriormente, varios estudios han establecido la capacidad de los genes reparadores para modular la frecuencia de los trastornos del material hereditario. El patrón observado de daño al ADN es el resultado de un equilibrio entre el daño y la reparación del ADN, y niveles bajos de daño o ninguna correlación fuerte pueden resultar de un bajo recuento de daños o de una alta eficiencia de reparación individual.
Según algunas estimaciones, la mayor contribución al aumento de los indicadores del ADN de los cometas debido a factores no productivos la hacen la estación del año (los parámetros aumentan en verano) y la exposición médica. En nuestro trabajo estos factores no pueden tener una influencia significativa, ya que la recolección de material biológico se realizó en el período invernal del año, y se excluyó de la muestra a todas las personas que se sometieron a exámenes radiológicos durante los 3 meses anteriores al estudio. . La falta de correlaciones con las concentraciones volumétricas de radón puede deberse al pequeño tamaño de la muestra. En el futuro se prevé continuar con esta línea de investigación con un aumento del tamaño de la muestra.
Conclusión
Estudiar los efectos de la exposición prolongada a dosis bajas de radiación parece ser una tarea difícil; la necesidad de seleccionar muestras y controlar los factores asociados puede distorsionar la imagen. En el estudio presentado, no fue posible identificar correlaciones estadísticamente significativas con los indicadores de actividad volumétrica del radón, pero al mismo tiempo las correlaciones detectadas con los indicadores de fondo gamma indican las perspectivas de este estudio. Existe una evidente necesidad de evaluar el factor de eficiencia reparadora de los examinados para un estudio de este tipo, esto permitiría diferenciar y comparar personas con características reparadoras similares;
No existen conflictos de intereses relacionados con este estudio.
El estudio se llevó a cabo con el apoyo financiero de la Fundación Rusa para la Investigación Básica (Nº 16-34-60069\15 mol_a_dk).
Enlace bibliográfico
Larionov A.V., Volobaev V.P., Serdyukova E.S. ESTUDIO DE INDICADORES DE ADN DE COMETA EN DONANTES SALUDABLES BAJO DIFERENTES PARÁMETROS DE RADIACIÓN DE LOCALES RESIDENCIALES // Problemas modernos de la ciencia y la educación. – 2017. – núm. 6.;URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27215 (fecha de acceso: 01/02/2020). Llamamos su atención sobre las revistas publicadas por la editorial "Academia de Ciencias Naturales".
El método de electroforesis en gel unicelular, o método del ADN cometa, es muy sensible y proporciona resultados muy fiables, al mismo tiempo que es relativamente sencillo y rápido de realizar y está estandarizado internacionalmente (OCDE nº 489). Este método es el más prometedor para resolver los siguientes problemas:
Biovigilancia de los seres humanos y del medio ambiente, es decir, identificación de las consecuencias de la mutagénesis inducida por el contacto humano con xenobióticos (medicamentos, aditivos alimentarios, pesticidas, perfumes y cosméticos, productos químicos domésticos, así como los contaminantes más comunes del agua, el aire y la industria). peligros, nanomateriales);
Investigación en oncología;
Investigación sobre sistemas de reparación del ADN;
El método se basa en el registro de la diferente movilidad en un campo eléctrico constante del ADN dañado y/o de fragmentos de ADN de células individuales lisadas encerradas en un fino gel de agarosa sobre un portaobjetos de vidrio estándar. En este caso, el ADN de la célula migra, formando un rastro electroforético que visualmente se asemeja a una "cola de cometa", cuyos parámetros dependen del grado de daño del ADN. Una vez completada la electroforesis, los portaobjetos se tiñen y se analizan mediante microscopía de fluorescencia.
La adquisición de imágenes y el procesamiento de datos se llevan a cabo mediante un complejo de hardware y software que incluye una cámara de alta sensibilidad combinada con un microscopio y un software especializado.
Software inteligente versátil incluido en este complejo, proporciona:
La automatización del análisis de imágenes de cometas de ADN "con una sola pulsación de tecla" incluye todos los parámetros de medición básicos, incluidos % ADN en la cola del cometa;
- alta reproducibilidad;
El análisis de los parámetros del ADN de los cometas se realiza tanto en “tiempo real” como a partir de imágenes digitales guardadas;
El programa procesa los datos y los muestra en forma de protocolo de acuerdo con requisitos internacionales BPL;
Análisis y comparación de datos;
El programa está totalmente validado y cumple con los requisitos internacionales de GLP. Tiene acceso jerárquico y un sistema de protección de datos.
El kit incluye:
1. Microscopio médico y biológico fluorescente Nikon Eclipse Ni-E.
2. Sistema de iluminación epifluorescente de 50W de potencia, kits filtro-espejo dicroico-filtro para colorantes DAPI, FITC, TRITC.
3. Cámara de vídeo monocromática CCD IEEE1394 FireWire para luminiscencia. Basler scA1300-32fm. Tamaño de píxel: 3,75 µm x 3,75 µm. Resolución: 1296 px x 966 px. El tamaño del sensor es de 1/3 de pulgada. Matriz - Sony. Transmisión de datos a través del puerto de alta velocidad - BUS 1394. La velocidad de visualización de fotogramas a resolución máxima es de 32 fotogramas/seg. Proporciona trabajo con objetos en tiempo real.
4. Comet Assay IV: un paquete de software para Windows con un generador de hojas de cálculo para Microsoft Excel, para trabajar con una videocámara monocromática CCD IEEE1394 FireWire en tiempo real (es posible realizar mediciones y análisis tanto en transmisiones de video como en fotografías), instrucciones de funcionamiento y CD para instalación y validación del programa.
5. Licencia por un año para cuatro usuarios.
6. Aprendizaje a distancia vía Internet para cuatro usuarios.
Se ofrece adicionalmente:
1. Operador de datos para utilizar Comet Assay IV en versiones XML de bases de datos para filtrado de búsqueda y extracción y auditoría de datos a través de una base de datos Oracle segura con guardado en formato MS Excel para trabajar en hojas de cálculo. Incluye la capacidad de ver imágenes guardadas automáticamente, firmas, datos archivados y datos de auditoría automática. Además, incluye la capacidad de exportar datos firmados digitalmente y sin firmar al formato XML. Incluye Crypto-Key-Prov para ver datos firmados digitalmente en varios formatos.
2. Gestor de acceso al sistema GLP. Access Manager es un programa para monitorear y administrar el acceso de los empleados a las bases de datos. Un sistema unificado para la toxicología genética de PI. Incluye una auditoría integral del sistema. Auditoría externa. Administración de cuentas de usuario y actividades de usuario asociadas a programas, accesos, contraseñas, auditorías, etc. Utiliza Oracle para proteger de forma segura a los usuarios y auditar los datos. Cumplimiento total de las reglas finales de FDA 21 CFR Parte 11 para registros electrónicos y firmas electrónicas.
3. Formación de un usuario sobre la base de instrumentos perceptivos en el Reino Unido
La genotoxicidad, es decir, el efecto dañino de un compuesto particular sobre el genoma, y la carcinogenicidad son fenómenos relacionados. El método del ADN cometa permite evaluar el grado de daño al ADN genómico tanto de forma experimental, con fines científicos como al resolver problemas prácticos: evaluación de la influencia del medio ambiente o las condiciones de trabajo, seguimiento del material de trasplante durante la descongelación, en ingeniería de tejidos. El daño en el ADN detectado por la prueba del ADN cometa puede indicar una predisposición al cáncer y los cambios asociados con él. Un aumento en el número de cometas de daño en el ADN detectables es característico de las células tumorales. Y, aunque a lo largo de las décadas transcurridas desde su desarrollo, el método se ha generalizado sólo en áreas especializadas, puede encontrar aplicación en el diagnóstico y seguimiento del tratamiento de diversas enfermedades. Las ventajas de los cometas de ADN son la sensibilidad, los bajos requisitos de cantidad de material, un protocolo de operación rápido, relativa simplicidad y bajo costo.
El método del ADN cometa se utiliza para estudiar varios tipos de células, tanto en cultivo como en muestras de fluidos y tejidos biológicos. El principal requisito para el análisis del ADN del cometa es la transferencia de células de tejido a suspensión, por lo que al diseccionar animales de laboratorio, los fragmentos de órganos extraídos deben someterse a un procesamiento adecuado y las células contenidas en la sangre o el semen pueden examinarse directamente. El 80% de las neoplasias malignas son de origen epitelial. Los epitelios que están expuestos tanto a influencias externas como a influencias del entorno interno del cuerpo son los más adecuados para evaluar la genotoxicidad utilizando el método del ADN cometa. Una forma no invasiva de obtener células epiteliales humanas es untar el epitelio oral y recolectar material exfoliativo del epitelio del conducto lagrimal. Las células epiteliales orales viven de 10 a 14 días; la presencia de ADN dañado en ellas indica una exposición reciente a un compuesto genotóxico. Los estudios de integridad del ADN epitelial oral pueden ayudar a controlar la exposición a sustancias asociadas con actividad profesional y productos alimenticios.
Las células colocadas en agarosa sobre vidrio se tratan con una solución de lisis y, si es necesario, con enzimas específicas para determinados trastornos. La separación se lleva a cabo en tampón alcalino. El ADN sale de la célula y pasa al ánodo, formando un rastro que se puede ver con un microscopio de fluorescencia. Cuantas más roturas se produzcan en el ADN, más pronunciado será el movimiento de sus fragmentos. Después del procedimiento, los portaobjetos se neutralizan y se tiñen con tintes intercalados para visualizar el ADN. La evaluación de la movilidad electroforética del ADN se realiza mediante un microscopio de fluorescencia. Cuando prácticamente todo el ADN de una célula está fragmentado, suele ser una célula muerta. Si las células individuales tienen este grado de daño genómico, se excluyen del análisis.
El protocolo cometa de ADN alcalino más utilizado (separación a pH > 13) permite la detección de roturas de hebras simples y entrecruzamientos en el ADN y entre el ADN y las proteínas. El uso de tratamiento con álcalis durante la preparación de muestras aumenta la sensibilidad del método, ya que la mayoría de los agentes genotóxicos no introducen roturas de doble hebra en las cadenas de ADN, sino que forman roturas de una sola hebra o áreas con mayor sensibilidad a los álcalis. Además, se utilizan enzimas que introducen roturas en zonas del ADN con daños específicos. La formamidopirimidina ADN glicosilasa corta hebras de ADN en nucleótidos oxidados, formamida pirimidinas (adenina y guanina de anillo abierto) y otros derivados de guanina; OGG1 detecta purinas y formamidopirimidinas oxidadas, la endonucleasa III detecta pirimidinas oxidadas, la endonucleasa T4 V reconoce dímeros de pirimidina, la 3-metiladenina ADN glicosilasa II (AlkA) es específica para la 3-metiladenina; y la uracilo ADN glicosilasa detecta el uracilo incorporado erróneamente al ADN. Tales protocolos de procesamiento de materiales pueden ser necesarios para resolver problemas específicos, por ejemplo, en tejidos congelados aumenta el contenido de pirimidinas oxidadas y sitios de endonucleasa V T4, pero no se observan otras alteraciones. El método del ADN cometa con tratamiento con una enzima adecuada se puede utilizar para evaluar el estado del injerto antes del trasplante.
Una de las áreas del diagnóstico clínico en la que se utiliza la tecnología del ADN cometa es el diagnóstico de la infertilidad masculina. Debido a la estructura de los espermatozoides, aumenta el riesgo de daño a la estructura del ADN en estas células y los sistemas de reparación no compensan completamente las violaciones que se producen. En la infertilidad masculina, se observa un mayor grado de daño en el ADN del esperma. El número de roturas del ADN en los espermatozoides normalmente alcanza aproximadamente 10 6 - 10 7 por genoma, tanto en humanos como en ratones de laboratorio, lo que es mucho mayor que el número de roturas del genoma en los linfocitos o las células rojas de la médula ósea. La fertilización con un espermatozoide que contiene daños en el ADN activa procesos de reparación en el ovocito que restauran estos daños, pero aumenta el riesgo de mutaciones y enfermedades congénitas en el niño. La incidencia de aborto espontáneo se correlaciona con el grado de daño en el ADN del esperma. Esto se asocia con una mayor incidencia de enfermedades congénitas y trastornos del desarrollo en niños con ICSI.
El método del ADN cometa se utiliza no sólo para evaluar el estado del ADN, sino también para estudiar los procesos de reparación en las células. En este caso, las células en estudio se destruyen y el homogeneizado resultante se procesa en ADN, en el que primero se introduce un daño de cierto tipo y se agregan a la mezcla los nucleótidos y ATP necesarios para la reparación. La capacidad de un homogeneizado para restaurar ciertos daños se utiliza para juzgar la actividad de los sistemas de reparación en las células. El tipo de daño que se introduce en el ADN depende del mecanismo de reparación que se esté estudiando. Por ejemplo, para evaluar la reparación por escisión de bases, se usa ADN dañado por la luz que contiene 8-oxoguanina, y para la reparación por escisión de nucleótidos, se usa ADN irradiado con luz ultravioleta que contiene dímeros de pirimidina. Las roturas de una sola cadena se introducen mediante tratamiento con peróxido de hidrógeno, irradiación con rayos X o rayos gamma y la alquilación del ADN se lleva a cabo mediante tratamiento con metanosulfonato de metilo. Para estudiar la reparación por escisión de nucleótidos, se utiliza una evaluación de la acumulación de roturas del ADN cuando se bloquean las polimerasas involucradas en este proceso usando afidocolina o arabinósido de citosina en combinación con hidroxiurea.
El análisis de la expresión de genes asociados con la reparación no siempre puede ser un indicador objetivo del estado del ADN en las células, por lo que el método del ADN cometa permite obtener información adicional valiosa. Una mayor actividad de los sistemas de reparación indica no sólo que las células son más resistentes al daño del genoma, sino también que están expuestas a un agente genotóxico, como resultado de lo cual se activa la síntesis de proteínas involucradas en la reparación. La suplementación con Q10, vitamina C en cápsulas de disolución lenta, aumenta la actividad reparadora por escisión de bases. Se observa un efecto similar si se utilizan frutas y verduras ricas en antioxidantes en lugar de medicamentos. Esto reduce la actividad del sistema de reparación por escisión de nucleótidos, ya que ya no es necesario.
La prueba de micronúcleos es un indicador directo de carcinogenicidad y las directrices del ICH recomiendan su uso en combinación con Comet DNA. La técnica del ADN cometa se puede combinar con la hibridación FISH fluorescente para determinar si los cambios afectan regiones específicas del genoma. Para el análisis de un gran número de rastros de ADN obtenidos como resultado del procedimiento del ADN del cometa. Se recomienda utilizar soluciones automatizadas. Esto reducirá la subjetividad de la evaluación y evaluará con mayor precisión el tamaño y la forma de los penachos formados, lo cual es especialmente importante dada la necesidad de recopilar datos sobre una gran cantidad de penachos en cada preparación. El ADN del cometa se puede utilizar como método de diagnóstico clínico y con fines de investigación para evaluar la genotoxicidad de un compuesto en particular.
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