ГУ НДІ харчування РАМН, Москва

Охратоксин А – вторинний метаболіт широко поширених мікроскопічних цвілевих грибів пологів Penicillium (P. verrucosum) та Aspergillius (A. ochraceus) стоїть у ряді пріоритетних мікотоксинів – контамінантів харчових продуктів, і становить реальну небезпеку для здоров'я людини. Охратоксин А має виражену нефротоксичну, канцерогенну, а також тератогенну, імунотоксичну, нейротоксичну, генотоксичну та цитотоксичну дію. Міжнародним агентством дослідження раку (IARC) охратоксин А віднесений до речовин, можливо канцерогенним для людини (група 2В) . При введенні всередину LD50 варіює для різних видівтварин від 20-30 мг/кг м. т. (для щурів) до 1 мг/кг м. т. (для свиней). Охратоксин А розглядається як один з етіологічних факторів Балканської ендемічної нефропатії - важкого ниркового захворювання, що реєструється в деяких східно- європейських країнах (зокрема Болгарії, Румунії, Сербії, Хорватії, Боснії та Герцеговині, Словенії, Македонії). Охратоксин А найчастіше виявляється у зернових продуктах, каві, спеціях. У Останнім часомз'являються дані про значне забруднення охратоксином А сухофруктів, вина та фруктових соків. Так, в результаті досліджень, проведених у країнах ЄС, було встановлено, що близько 70% партій зернових продуктів містили охратоксин А в діапазоні від 0,00001 до 0,041 мг/кг, близько 60% досліджених партій вина були забруднені охратоксином А у кількості від 0 ,000003 до 0,016 мг/л. На особливу увагу заслуговують дані про часте виявлення охратоксину А в крові, а також материнському молоці населення багатьох європейських країн, що свідчить про постійне надходження цього мікотоксину в організм людини. Основний внесок у величину надходження охратоксину А з продуктами харчування вносять зернові (44%), вино (10%) та каву (9%). Рекомендоване Об'єднаним комітетом експертів ФАО/ВООЗ харчовим добавкам(JECFA) допустиме тижневе споживання охратоксину А становить 100 нг/кг/м. т. . Вміст охратоксину А в країнах ЄС регламентується на рівні 0,005 мг/кг у продовольчій сировині та 0,003 мг/кг у продуктах харчування. Достовірні дані про забруднення харчових продуктів охратоксином А РФ відсутні.

Розроблений раніше для потреб санітарно-епідеміологічної служби СРСР метод визначення охратоксину А в харчових продуктах, що використовує рідко-рідинний розподіл для очищення екстракту, має ряд недоліків: відносно низька чутливість методу (межа виявлення - 0,001-0,002 мг/кг), значна а також необхідність використання великої кількостіхлорвмісних органічних розчинників.

На цей час розроблено нові більш ефективні методивизначення охратоксину А в харчових продуктах, засновані на застосуванні твердофазної екстракції (ТФЕ). Для ТФЕ характерна хороша очистка екстракту, високий рівень вилучення і мала витрата розчинників. При ТФЕ використовують нормально-фазову адсорбційну хроматографію на силікагелі тингу та ін. ).

Слабокислотні властивості (рКА = 4,4) охратоксину А (рис.1) визначають необхідність його екстракції або у недисоційованій формі сумішами органічних розчинників з кислотними водно-сольовими розчинами, або у вигляді солі-водними слаболужними розчинами, наприклад, розчином гідрокарбонату натрію.

Зворотно-фазова ВЕРХ (ОФ ВЕРХ) з флуориметричним детектуванням є найбільш поширеним методом визначення охратоксину А в харчових продуктах.

Метою дослідження стала розробка чутливого методу виявлення, ідентифікації та кількісного визначенняохратоксину А в харчових продуктах шляхом оптимізації аналітичних підходів, що ґрунтуються на використанні ТФЕ.

експериментальна частина

Апаратура та реагенти. Хроматографічна система складалася з насоса високого тиску Jasco 880-PU, інжектора Rheodyne-7125 з об'ємом петлі-дозатора 20 мкл, флуориметричного детектора FL Detector model LC305 (Linear Instruments) (лвозб.=250 нм, 4=250 нм, 4=250 нм, 4 = 250 нм, 4 збору та обробки даних «Мультихром» (Амперсенд). Хроматографічна колонка (250*4,6 мм) з нерухомою фазою Kromasil C18 (MetaChem Technologies Inc.), з розміром частинок 5 мкм.

Екстракцію проводили з використанням апарату для струшування shaker s-3.08L (ELMI), для центрифугування проб використовували центрифугу ЦЛС 31М. Твердофазну екстракцію проводили з використанням маніфолду Macherey-Nagel, патронів ДІАПАК Силікагель (БіоХімМак СТ), імуноафінних колонок (ІАК) OCHRAPREP (R-BIOFARM RHONE LTD). рН розчинів вимірювали рН-метром МР 230 (Mettler Toledo). Концентрування проб проводилося на роторному випарнику Laborota 4000 (Heidolph). Для розчинення стандартів та випарених екстрактів використовувалася ультразвукова ванна УЗВ-12л (ПКФ САПФІР). Для підбору оптимальних хвиль збудження та емісії використаний флуоресцентний спектрофотометр Cary Eclipse (Varian). Як стандарт використовувався стандартний зразок охратоксину А в суміші бензол- оцтова кислота(99:1) із концентрацією С = 9,2 нг/мкл.

Твердофазна екстракція:

Очищення за допомогою колонкової хроматографії (КХ) на діатомітовій землі. Екстракцію охратоксину А з 25,0 г подрібненої проби проводили 125 мл хлороформу після додавання 20 мл 2% оцтової кислоти. Перемішували на апараті для струшування протягом 30 хвилин. 50 мл пропущеного через паперовий фільтр екстракту хлороформного наносили на колонку з діатомітовою землею, імпрегнованої гідрокарбонатом натрію. Колонку послідовно промивали 70 мл гексану і 30 мл хлороформу. Охратоксин А елюювали з колонки 150 мл суміші бензол - оцтова кислота (86:12:2). Елюат випарювали насухо, розчиняли в 3 мл рухомої фази (ацетонітрил – водна Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) з використанням ультразвукової ванни.

Очищення за допомогою КХ на силікагелі. Екстракцію охратоксину А з 20,0 г подрібненої проби проводили 100 мл толуолу після послідовного додавання 30 мл 2М розчину соляної кислоти і 50 мл 0,4М розчину хлориду магнію. Перемішували 60 хвилин, центрифугували зі швидкістю 3500 об/хв 5 хвилин. Верхній толуоловий шар відфільтровували через паперовий фільтр, відбираючи 50 мл фільтрату. Після кондиціонування 10 мл толуолу на патрон із силікагелем наносили 50 мл фільтрату, двічі промивали 10 мл н-гексану і 10 мл суміші толуол – ацетон (85:15), потім 5 мл толуолу. Охратоксин А елюювали 40 мл суміші толуол – ацетон – оцтова кислота (89:10:1). Елюат упарювали насухо, розчиняли в 1 мл рухомої фази (ацетонітрил – водна Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) з використанням ультразвукової ванни.

Очищення за допомогою імуноафінної КХ. Екстракцію охратоксину А з 50,0г. подрібненої проби проводили 200 мл суміші ацетонітрил - вода (60:40). Перемішували протягом 30 хвилин. 4 мл пропущеного через паперовий фільтр екстракту змішували з 44 мл фосфатного і наносили на імуноафінну колонку (ІАК), яку потім промивали 20 мл фосфатного буфера. Залишки фосфатного буфера видаляли продуванням повітрям ЯК. Охратоксин А елюювали 3 мл суміші метанол - оцтова кислота (98:2). Елюат упарювали насухо, розчиняли в 1 мл рухомої фази (ацетонітрил – водна Н3РО4 (рН=2.6) (62:38) з використанням ультразвукової ванни.

Умови ВЕРХ. Ідентифікацію та кількісне визначення охратоксину А проводили методом ОФ ВЕРХ у режимі ізократичного елюювання з флуоресцентним детектуванням (лвозб.=250 нм, леміс.=458 нм). Як рухливу фазу використовували суміш ацетонітрил – водна Н3РО4 (рН=2.6) (62:38). Швидкість елюювання становила 1 мл/хв. У систему ВЕРХ вводилося 20 мкл досліджуваного розчину.

Результати та їх обговорення.

При очищенні екстракту шляхом КХ з діатомітовою землею, імпрегнованої гідрокарбонатом натрію, в якості базового був використаний метод АОАС 975.38 , що передбачає застосування ТШХ для ідентифікації та кількісного визначення охратоксину А. Нами з метою підвищення чутливості та специфічності методу була використана. В результаті застосування базового методу ступінь вилучення охратоксину А з матриксу, штучно контамінованого охратоксином А на рівні 0,01 мг/кг, у наших умовах не перевищив 40%. З метою підвищення величини вилучення нами було внесено цілу низку змін до умов екстракції та очищення: до складу екстрагуючої суміші було додано оцтову кислоту; об'єм хлороформу, який використовується для промивання колонки, зменшений до 30 мл; до складу елююючої суміші внесено ацетон; обсяг елююючої суміші збільшений до 150 мл. Внаслідок оптимізації методу величина вилучення охратоксину А з пшениці зросла до 60% (табл.1).

Ступінь вилучення вдалося суттєво підвищити, застосувавши метод твердофазної екстракції на патронах з немодифікованим силікагелем (схема, наближена до методу ICC № 000). Коригування базового методу (збільшено вміст толуолу в суміші толуол – ацетон, що використовується для промивання колонки, до 85%, до складу елююючої суміші внесено ацетон, обсяг елююючої суміші доведено до 40 мл) дозволило збільшити ступінь вилучення до 80%.

При використанні імуноафінної КХ спостерігалася максимальна ступінь вилучення охратоксину А з харчового матриксу (до 100%), При цьому межа виявлення (0,0005 мг/кг) була вищою, ніж при очищенні КХ на силікагелі (0,00005 мг/кг).

Для виявлення, ідентифікації та кількісного визначення охратоксину А за допомогою ВЕРХ був підібраний оптимальний склад рухомої фази (ПФ) та уточнено довжини хвиль збудження та емісії флуоресценції, що забезпечили максимальний сигнал та селективність при детектуванні охратоксину А (табл.2). Підібрана довжина хвиль збудження (250 нм замість 333 нм) та емісії флуоресценції для оптимізованої рухомої фази дозволила підвищити співвідношення сигнал/шум з відповідним зниженням межі виявлення методу. Зміна складу ПФ дозволило покращити поділ піків охратоксину А та компонентів матриксу харчового продукту при одночасному зниженні часу утримання піку охратоксину А (рис.2).

Можливість використання розробленого нами модифікованого методу, заснованого на застосуванні патронів із силікагелем, у рутинному аналізі охратоксину А була підтверджена вибірковим дослідженням частоти та рівня забруднення цим мікотоксином основних видів продовольчої сировини. І тому було вивчено продовольче зерно врожаю 2004 року з різних регіонів РФ (табл.3). Дев'ять із 46 досліджених зразків зерна містили охратоксин А в діапазоні від 0,00005 до 0,005 мг/кг, що не перевищувало регламентів, прийнятих у країнах ЄС.

Таким чином, шляхом оптимізації існуючих аналітичних підходів запропоновано два варіанти методу виявлення, ідентифікації та кількісного визначення охратоксину А в харчових продуктах: з використанням КХ на силікагелі або імуноафінної КХ для очищення екстрактів та оптимізованих умов ВЕРХ. Метод, заснований на застосуванні КХ на силікагелі, відрізняється низькою межею виявлення та невисокою вартістю витратних матеріалів. Очищення за допомогою імуноафінної КГ забезпечує високий ступінь вилучення та чистоту екстракту, а також характеризується більш високою межею виявлення (0,0005 мг/кг замість 0,00005 мг/кг для варіанта з очищенням КХ на силікагелі). Отримані в результаті проведеного вибіркового дослідження вмісту охратоксину А в продовольчій сировині дані свідчать необхідність подальшого вивчення забруднення охратоксином А продуктів харчування з метою оцінки ризику контамінації цим мікотоксином харчових продуктів для здоров'я населення РФ.

ГУ НДІ харчування РАМН

109240, Москва, Устьинський проїзд, д.2/14

I. V. Aksenov, K. I. Eller, V. A. Tutelyan

Optimization аналітичних методів для ochratoxin A analysis in food.

Ochratoxin A is a mycotoxin виробляється з широко distributed Aspergillus and Penicillium species. Mycotoxin є особливим contaminant з cereals, coffee, wine, затверджених фруктів і пряностей. Ochratoxin A been shown to be nephrotoxc, immunosuppressive, embryotoxic, teratogenic і carcinogenic в багатьох mammalian species. Codex Alimentarius і EC має встановлений максимальний допустимий рівень 5 мг/кг для ochratoxin A в срібних отворах і з 3 мг/кг – для ready-to-eat products derived from cereals. Два прямі і надійні зміни методів повинні були розробити для аналізу ochratoxin в матеріалі, які ґрунтуються на імунітетній або silica gel column clean-up and HPLC with fluorescence detection. Відмітні обмеження були 0,5 мг/кг і 0,05 мг/кг відповідно. Методи повинні бути використані успішно для аналізу ochratoxin A в 46 текстів з невеликих cereals harvested в різних регіонах Росії. Нині сamples були зведені до бути потерпілого з ochratoxin A на рівні, що від 0,05 до 5 мг/кг.

Оптимізація аналітичних методіввиявлення, ідентифікації та кількісного визначення охратоксину А в харчових продуктах.

Охратоксин А – мікотоксин, що продукується широко поширеними пліснявими грибами пологів Aspergillius та Penicillium. Він є частим контамінантом зернових продуктів, кави, вина, сухофруктів та спеції. Доведено нефротоксичну, імуносупресивну, ембріотоксичну, тератогенну та канцерогенну дію охратоксину А для багатьох видів ссавців. Встановлений Кодексом Аліментаріус та ЄС максимальний допустимий рівеньвміст охратоксину А в зерні дорівнює 5 мкг/кг, у готових до вживання зернових продуктах – 3 мкг/кг. Запропоновано два оптимізовані методи виявлення, ідентифікації та кількісного визначення охратоксину А в харчових продуктах: з використанням КХ на силікагелі або імуноафінної КХ для очищення екстрактів та ВЕРХ з флуоресцентною детекцією. Межа виявлення склала відповідно 0,05 і 0,5 мкг/кг. Розроблені методи використані для аналізу вмісту охратоксину А в 46 зразках зерна, зібраного у різних регіонах Росії. Дев'ять зразків були забруднені охратоксином А у кількості від 0,05 до 5 мкг/кг.

Підписи до малюнків.

Малюнок 1. Хімічна структура охратоксину А.

Малюнок 2. Хроматограми зразка пшениці, контамінованого охратоксином А на рівні 0,01 мг/кг, при різних способах очищення:

А) КХ на діатомітовій землі Б) КХ на силікагелі В) імуноафінна КХ.

Таблиця 1. Порівняльна характеристика різних способівочищення екстракту.

Таблиця 2. Порівняльна характеристика параметрів ВЕРХ (для 1 нг охратоксину А у поколі).

	склад ПФ	Довжини хвилі флуориметричного детектування, нм	Час утримання охр. А, хв	Відношення сигнал/шум
ацетонітрил – вода – оцтова кислота (99:99:2)
ацетонітрил – вода – оцтова кислота (102:94:4)
Оптимізована методика
ацетонітрил - водна Н3РО4 (рН = 2.6) (124:76)

Таблиця 3. Вибіркове дослідження рівня забруднення охратоксином А продовольчого зерна врожаю 2004р.

Література

Методичні рекомендації щодо виявлення, ідентифікації та визначення вмісту охратоксину А в харчових продуктах. - М., 1985. , Кравченко (Медичні та біологічні аспекти) - М., 1985. - 2001. - Vol. 84. - P. 1818. AOAC, Ochratoxin A в Corn та Barley 991.44 // J. AOAC Int. - 1996. - Vol. 79. - P. 1102-1105. AOAC, Ochratoxin A в Green Coffee 975.38 // J. AOAC Int. - 1975. - Vol. 58. - P. 258. Application note for analisis of ochratoxin A в cereal using sodium bicarbonate extracton in conjunction with Ochraprep. - Glasgow, 2001. Baggiani C., Giraudi G., Vanni A. / / Bioseparation. – 2002. – Vol.10. - P. 389-mission Regulation (EC) № 000/2002 // Official Journal of the European Communities. – 2002. – L 75. – P. 18-20. IARC Monographs на Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. Vol. 56. - Lion, 1993. Jodlbauer J., Maier N. M., Lindner W. // Journal of Chromatography A. - 2002. - Vol. 945. - P. 45-63. Jornet D., Busto O., Guasch J // Journal of Chromatography A. – 2000. – Vol. 882. - P. 29-35. Krogh P. // Endemic nephropathy, Proceedings of the second International Symposium on Endemic nephropathy 9-12 November 1972. - Sofia, 1972. - P. 266-277. Kuhn I., Valenta H., Rohr K. // Journal of Chromatography B. – 1995. – Vol. 668. - P. 333-337. Majerus P., Weber R., Wolff J. // Bundesgesundheitsblatt. - 1994. - B. 37, N. 11. - S. 454 - 458. Monaci L., Palmisano F. / / Anal. Bioanal. Chem. – 2004. – Vol. 378. – P. 96-103. Monaci L., Tantillo G., Palmisano F.// Anal. Bioanal. Chem. – 2004. – Vol. 378. - P. 1777-1782. Quantitative detection of Ochratoxin A.- Glasgow, 2003. Report of experts participating in Task 3.2.7 “Assessment of dietary intake of Ochratoxin A by the population of EU Member States”. - Rome, 2002. Safety evaluation of certain mycotoxins in food. // WHO Food Additives Series, No.47; FAO Food and Nutrition Paper 74. - Geneva, 2001. Schwartz G. G. // Cancer Causes Control. – 2002. – Vol.13. – P. 91-100. Scott P. M. // Adv. Exp. Med. Biol. – 2002. – Vol. 504. - P. 117-134. Skaug MA, Helland I, Solvoll K, Saugstad O. D. // Food Addit. Contam. – 2001. – Vol. 18. - P. 321-327. Visconti A., Pascale M., Centonze G. // Journal of Chromatography A. - 1999. - Vol. 864. - P. 89-101. Zimmerli B., Dick R. // Journal of Chromatography B. - 1995. - Vol. 666. - P. 85 - 99.

стор 1

стор 2

стор 3

стор 4

стор 5

стор 6

стор 7

стор 8

стор 9

стор 10

стор 11

стор. 12

стор 13

стор 14

стор. 15

стор. 16

стор. 17

стор 18

стор 19

МІЖДЕРЖАВНА РАДА З СТАНДАРТИЗАЦІЇ, МЕТРОЛОГІЇ ТА СЕРТИФІКАЦІЇ

INTERSTATE COUNCIL FOR STANDARDIZATION, METROLOGY AND CERTIFICATION

МІЖДЕРЖАВНИЙ

СТАНДАРТ

ЗЕРНО ТА ПРОДУКТИ ЙОГО ПЕРЕРОБКИ, КОМБІКОРМА

Визначення охратоксину А методом високоефективної рідинної хроматографії

(ІSO 15141-1:1998, NEQ)

Видання офіційне

Стандартінформ

Передмова

Цілі, основні засади та основний порядок проведення робіт із міждержавної стандартизації встановлено ГОСТ 1.0-92 «Міждержавна система стандартизації. Основні положення» та ГОСТ 1.2 –2009 «Міждержавна система стандартизації. Стандарти міждержавні, правила та рекомендації щодо міждержавної стандартизації. Правила розробки, прийняття, застосування, оновлення та скасування»

Відомості про стандарт

1 РОЗРОБЛЕНО Товариством з обмеженою відповідальністю «Люмекс-маркетинг» (ТОВ «Люмекс-маркетинг»)

2 ВНЕСЕН Федеральним агентством з технічного регулювання та метрології (ТК 335)

3 ПРИЙНЯТЬ Міждержавною радою зі стандартизації, метрології та сертифікації (протокол від 14 листопада 2013 р. № 44-2013)

4 Цей стандарт відповідає основним положенням міжнародного стандарту ISO 15141-1:1998 Foodstuffs - Визначення ochratoxin A в зернах та зернових продуктах - Визначення вмісту охратоксину А. рідинної хроматографії з очищенням силікагелі).

Ступінь відповідності – нееквівалентна (NEQ)

5 Наказом Федерального агентстваз технічного регулювання та метрології від 30 грудня 2013 р. N2 2429-ст міждержавний стандарт ГОСТ 32587-2013 введено в дію як національний стандарт Російської Федераціїз 1 липня 2015 р.

6 ВВЕДЕНО ВПЕРШЕ

7 ПЕРЕВИДАННЯ. Березень 2016

Інформація про зміни до цього стандарту публікується у щорічному інформаційному покажчику «Національні стандарти», а текст змін та поправок – у щомісячному інформаційному покажчику «Національні стандарти». У разі перегляду (заміни) або скасування цього стандарту відповідне повідомлення буде опубліковане у щомісячному інформаційному покажчику «Національні стандарти». Відповідна інформація, повідомлення та тексти розміщуються також у інформаційної системизагального користування - на офіційному сайті Федерального агентства з технічного регулювання та метрології у мережі Інтернет.

© Стандартінформ, 2016

У Російській Федерації цей стандарт не може бути повністю або частково відтворений, тиражований і поширений як офіційне видання без дозволу Федерального агентства з технічного регулювання та метрології.

Примітка - Наведені обсяги елюювання слід змінити відповідно до значень, отриманих при визначенні коефіцієнта проходження охратоксину А (див. 5.3.10).

5.4.4 Проведення хроматографічних вимірів

Реєструють не менше двох хроматограм концентрату випробуваної проби, отриманого за 5.4.3, у тих же умовах, за яких було проведено градуювання системи. Ідентифікацію охратоксину А проводять за збігом часу утримання охратоксину А в екстракті проби з його часом утримування, отриманим при контролі стабільності градуювальної характеристики, встановивши ширину вікна ідентифікації 5%.

Приклад хроматограми наведено малюнку А.1 (додаток А).

За наявності на хроматограмі концентрату проби піку, ідентифікованого як пік охратоксину А, роблять висновок про присутність охратоксину А в пробі, визначають його вміст за кожною зареєстрованою хроматограмою та перевіряють розбіжність отриманих значень між собою, використовуючи формулу (2).

Якщо умова формули (2) виконується, то як результат вимірювань масової концентрації охратоксину А в концентраті випробуваної проби приймають середньоарифметичне значення отриманих концентрацій. Якщо умова формули (2) не виконується, знаходять і усувають причини нестабільності, після чого введення концентрату проби повторюють.

При необхідності підтвердження правильності ідентифікації піку охратоксину А рекомендується виконати добавку розчину охратоксину А рухомий фазі до концентрату проби. Про достовірність ідентифікації можна судити зі збільшенням висоти передбачуваного піку охратоксину А. Кількість розчину охратоксину А, що додається, визначають, виходячи з того, що масова частка охратоксину А в пробі повинна збільшитися на 50 % -150 % порівняно з вихідним значенням.

Якщо масова концентрація охратоксину А в кінцевому концентраті С х перевищує 100 нг/см 3 його розбавляють рухомий фазою (див. 5.3.2.1). Коефіцієнт розведення Q обчислюють за формулою

(8)

де Vp - об'єм розведеного концентрату випробуваної проби, см 3 ;

V a - обсяг аліквоти вихідного концентрату випробуваної проби, взятий для розведення,

5.5 Обробка результатів випробувань

Масову частку охратоксину А в пробі X, млн" 1 обчислюють за формулою

X = V 1-V 2 "C X .Q.10 \ (9)

де Vi - обсяг хлороформу, взятого для екстракції, см 3 (30 см 3);

V 2 - обсяг кінцевого концентрату проби, см 3 (0,5 см 3);

Сх - масова концентрація охратоксину А в кінцевому концентраті проби (див. 5.4.4), нг/см 3; V 3 - обсяг хлороформного екстракту, взятого для випробувань 5.4.3, см 3 (20 см 3);

/л - маса навішування, г;

П – коефіцієнт проходження охратоксину А (див. 5.3.10);

Q-коефіцієнт розведення концентрату проби (див. 5.4.4);

5.6 Метрологічні характеристики

Метод забезпечує отримання результатів вимірювань з метрологічними характеристиками, що не перевищують значень, наведених у таблиці 2.

Таблиця 2

Діапазон вимірювань, млн" 1 Межа повторюваності г, млн" 1 Межа відтворюваності R, млн" 1 Показник точності (кордону ** абсолютної похибки при довірчій ймовірності Р = 0,95), ± Д, млн" 1 Від 0,0025 до 0,05 вмикання. Св. 0,05 » 1,0 » X-результат вимірювань по 5.5, млн-1. ** Встановлені числові значення меж абсолютної похибки відповідають числовим значенням розширеної невизначеності U (в абсолютних одиницях) за коефіцієнта охоплення до = 2.

Розбіжність між двома результатами вимірювань (Х| і Х 2 , млн" 1), отриманими в одній лабораторії в умовах повторюваності, має відповідати умові

\Х 1 -Х 2 \<г, (10)

де г - межа повторюваності, млн" 1 (таблиця 2).

При виконанні умови (10) за результат вимірювань приймають середньоарифметичне отриманих результатів вимірювань (Xj і Х 2 млн 1).

Розбіжність між двома результатами вимірювань, отриманими у двох лабораторіях (Xi na 6 і Х 2ла б, млн" 1) на ідентичних пробах, має відповідати умові

де R - межа відтворюваності, млн" 1 (таблиця 2).

5.7 Контроль якості результатів вимірів

Контроль показників якості результатів вимірювань у лабораторії передбачає проведення контролю стабільності результатів вимірювань з урахуванням вимог ДСТУ ISO 5725-6 (розділ 6).

I

5.8 Оформлення результатів випробувань

Результати випробувань реєструють у протоколі випробувань, який оформлюють відповідно до вимог ГОСТ ІСО/МЕК 17025, при цьому протокол випробувань повинен містити посилання на цей стандарт.

Результати вимірювань вмісту охратоксину А (при підтвердженому в лабораторії відповідності аналітичної процедури вимогам цього стандарту) подають у вигляді

Х±Д, млн" 1 або X±U, млн" 1, (12)

де X - результат вимірювань, отриманий відповідно до 5.6, млн" 1 ;

А - межі абсолютної похибки вимірювань вмісту охратоксину А (Р = 0,95)

таблиці 2, млн" 1;

U - розширена невизначеність при коефіцієнті охоплення = 2, млн" 1 .

Числові значення меж абсолютної похибки (невизначеності) виражають числом, що містить трохи більше двох значущих цифр, у своїй найменший розряд числового значення остаточного результату вимірювань приймають так само, як і найменший розряд числового значення меж абсолютної похибки (невизначеності).

6 Метод Б

6.1 Сутність методу

Метод заснований на екстракції охратоксину А толуолом після підкислення випробуваної проби соляною кислотою і додавання магнію хлориду для збільшення іонної сили. Екстракт очищають з використанням колонок для твердофазної екстракції, заповнених силікагелем, і визначають вміст охратоксину А методом ВЕРХ на звернено-фазовій колонці із застосуванням флуориметричного детектування. При необхідності підтвердження ідентифікації охратоксину А шляхом дериватизації розчином трифториду бору в метанолі.

6.2 Реактиви

При проведенні випробувань використовують воду по 5.2.13, реактиви по 5.2.14 - 5.2.17, а також наведені нижче.

6.2.7 Розчинник змішаний № 1: толуол (див. 6.2.3) та оцтова кислота крижана (див. 5.2.15) в об'ємному співвідношенні 99: 1.

6.2.8 Розчинник змішаний № 2: ацетон (див. 6.2.5) та толуол (див. 6.2.3) в об'ємному співвідношенні 5: 95.

6.2.9 Розчинник змішаний № 3: толуол (див. 6.2.3) та оцтова кислота крижана (див. 5.2.15) в об'ємному співвідношенні 90: 10.

6.2.10 Рухома фаза

Змішують 99 об'ємних частин ацетонітрилу (див. 5.2.16) з 99 об'ємними частинами води (див.5.2.13) та двома об'ємними частинами крижаної оцтової кислоти (див. 5.2.15). Перед вживанням рухому фазу дегазують.

6.2.11 Трифторид бору, масова частка основної речовини не менше

6.2.12 Розчин бору трифториду в метанолі, р (BF 3) = 14 г/100 см 3 .

УВАГА! Працювати необхідно в добре діючій витяжній шафі. Слід уникати потрапляння на шкіру, очі та органи дихання.

6.2.13 Охратоксин А у кристалічній формі або у вигляді ампульного препарату у плівковій формі з масовою часткою основної речовини не менше 95 %

6.2.14 Охратоксин А, вихідний розчин

Розчиняють 1 мг кристалічного охратоксину А (див. 6.2.13) або вміст ампули з плівкою, що містить охратоксин А, в такому обсязі змішаного розчинника № 1 (див. 6.2.7), щоб одержати розчин масової концентрації охратоксину А від 20 до 30 мкг /див 3 .

Для визначення точного значення масової концентрації охратоксину А в основному розчині реєструють його оптичну густину в діапазоні довжин хвиль від 300 до 370 нм з кроком 5 нм в кварцовій кюветі з товщиною оптичного шару 1 см 6.3.2 з використанням спектрофотометра (1). ). Як розчин порівняння використовують змішаний розчинник № 1 по 6.2.7. Ідентифікують точне положення максимуму поглинання, реєструючи оптичну густину поблизу нього з кроком 1 нм. Розраховують значення масової концентрації охратоксину А, С вих, мкг/см 3 за формулою

де А макс - оптична густина в максимумі поглинання (в даному випадку при 333 нм);

М-молярна маса охратоксину А, г/моль (М=403,8 г/моль);

100 - коефіцієнт узгодження одиниць довжини та маси; е - молярний коефіцієнт поглинання охратоксину А в змішаному розчиннику № 1, м 2 /моль, (е= 544 м 2 /моль);

/-Товщина поглинаючого шару кювети, див.

6.2.15 Охратоксин А, проміжний розчин масової концентрації 1 мкг/см 3 Випарюють насухо в струмі азоту аліквоту вихідного розчину (див. 6.2.14), що містить 100 мкг охратоксину А, і розчиняють у 100 см 3 рухомої фази. 10). Об'єм аліквоти обчислюють за формулою:

\/ а - обсяг аліквоти, см 3;

100 - маса охратоксину А, мкг;

Це* - масова концентрація вихідного розчину охратоксину А до 6.2.14, мкг/см 3 .

Термін зберігання розчину в холодильнику при температурі від 2 до 6°С і регулярному контролі його стабільності - не більше 6 міс.

6.2.16 Градуювальні розчини охратоксину А

У мірні колби місткістю 100 см 3 поміщають 1; 2,5; 4 та 5 см 3 проміжного розчину охратоксину А (див.6.2.15) і розбавляють до мітки рухомою фазою (див. 6.2.10). Масова концентрація охратоксину А в приготовлених градуювальних розчинах становить 10; 25; 40 та 50 нг/см 3 відповідно, що відповідає масі охратоксину А 0,2; 0,5; 0,8 та 1,0 нг в обсязі дозування 20

6.3 Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, матеріали та посуд

При проведенні випробувань використовують засоби вимірювань, допоміжне обладнання, матеріали та посуд за 5.2.1 - 5.2.2, 5.2.6 - 5.2.11,5.2.21 -5.2.34, а також нижченаведене.

6.3.1 Спектрофотометр, придатний для вимірювання в діапазоні довжин хвиль від 300 до 370 нм і має спектральну ширину смуги не більше 2 нм.

6.3.2 Кювети кварцові з товщиною шару поглинання 1 см, що не поглинають світло в діапазоні довжин хвиль від 300 до 370 нм.

6.3.3 Пробірки центрифужні, наприклад місткістю 250 см 3 , виконані з поліетилену високого тиску з кришкою, що загвинчується.

6.3.4 Центрифуг з охолодженням, бажано рефрижераторний, для центрифужних пробірок (див. 6.3.3), здатний до створення прискорення не менше 3500 д.

Примітка - Швидкість обертання центрифуги, що забезпечує вказане прискорення, вибирають відповідно до рекомендацій виробника центрифуги.

6.3.5 Колонка для твердофазної екстракції одноразова, заповнена силікагелем.

Після розкриття упаковки колонку кондиціонують протягом двох годин при температурі 105 °З зберігають над активованим силікагелем з індикатором вологості. Перед використанням через колонку пропускають 10 см 3 толуолу (див. 6.2.3). З кожною новою партією колонок перевіряють вихід охратоксину А. Наприклад, придатні колонки, виконані з поліпропіленової трубки місткістю 3 см 3 з наступними характеристиками:

Середня маса силікагелю – 690 мг;

Розмір часу - 12,5 нм;

Розмір частинок – від 55 до 105 мкм.

6.3.6 Резервуари для розчинників, такі як шприци місткістю, наприклад, 50 см 3 з центральним отвором і пробкою.

6.3.7 Воронка ділильна місткістю 50 см 3 за ГОСТ 25336 .

6.3.8 Фільтри мембранні для водних розчинів, виготовлені з політетрафторетилену, з розміром пор 0,45 мкм.

6.3.9 Віали з обтискною або кришкою, що загвинчується.

6.3.10 Мікрошпіриць місткістю 500 мм 3 .

6.3.11 Апаратура для високоефективної рідинної хроматографії

6.3.11.1 Хроматограф рідинний за 5.2.1.

Довжина................................................. ..250 мм;

Внутрішній діаметр....................................4 мм;

Розмір сферичних частинок........................5 мкм.

6.3.11.2 Колонка хроматографічна аналітична, заповнена звернено-фазовим сорбентом зерненням 5 мкм, що забезпечує поділ піку охратоксину А та інших піків до базової лінії 1 з такими характеристиками:

Примітка - Допускається використання аналітичних колонок інших типорозмірів (наприклад, довжиною від 120 до 150 мм).

6.3.11.3 Передколонка того ж внутрішнього діаметра і заповнена тим самим звернено-

фазовим сорбентом, що й аналітична колонка завдовжки

6.3.11.4 Передколонка того ж внутрішнього діаметра і заповнена тим же обернено-фазовим сорбентом, що і аналітична колонка, наприклад, з такими характеристиками:

Довжина................................................. ...40 мм;

Внутрішній діаметр...................................4 мм;

Розмір сферичних частинок........................5 мкм.

Примітка - Допускається використання передколонок інших типорозмірів.

Допускається застосування інших засобів вимірювань з метрологічними характеристиками та допоміжного обладнання з технічними характеристиками не гірше, а також матеріалів та реактивів за якістю не нижче за вищевказані.

6.4 Проведення випробувань

6.4.1 Загальні положення

Випробування мають бути проведені протягом одного робочого дня.

6.4.2 Екстракція охратоксину А з проби

Поміщають (20,0 ± 0,1) г проби, підготовленої до випробувань відповідно до розділу 3, в центрифужну пробірку (див. 6.3.3). При очікуваному вмісті охратоксину більше 0,005 млн" 1 масу проби зменшують до 10 г; в іншому випадку слід взяти до уваги можливий ризик зменшення охратоксину А з проби.

Послідовно додають 30 см 3 розчину соляної кислоти (див. 6.2.1), 50 см 3 розчину хлористого магнію (див. 6.2.2), перемішують скляною паличкою і додають 100 см 3 толуолу

Перемішують протягом 60 хв і потім центрифугують суспензію. Час центрифугування залежить від ефективності центрифуги. Центрифугування проводять при охолодженні для запобігання втратам толуолу. Відбирають аліквоту верхнього (толуольного) шару об'ємом 50 см 3 (2) і пропускають її через колонку для твердофазної екстракції, підготовлену по 6.3.5, з приєднаним до неї резервуаром (див. 6.3.6).

Примітка - Слід вжити заходів щодо недопущення навантаження колонки.

Колонку промивають двома порціями по 10 см 3 гексану (див. 5.2.17) і потім двома порціями змішаного розчинника № 2 (див. 6.2.8). Потім промивають 5 см 3 толуолу, відкидаючи усі елюати.

Елююють охратоксин А двома порціями по 15 см 3 змішаного розчинника № 3 (див. 6.2.9) в гостродонну колбу місткістю 50 см 3 (див. 5.2.25). Об'єднаний елюат обережно упарюють до сухого залишку при зниженому тиску та температурі не вище 40 °С. Залишок розчиняють в 1 см 3 (/ 3) рухомої фази (див. 6.2.10) і переносять у віалу (див. 6.3.9).

Примітки

1 Умови елюювання охратоксину А та наступних операцій можуть залежати від типу колонок для твердофазної екстракції. Наприклад, слід перевірити, чи зазначений вище обсяг елюенту застосовується типу колонок.

2 Розміри та/або форма колби можуть негативно впливати на вихід охратоксину А.

6.4.3 Умови хроматографічного аналізу

ліз проводять у таких умовах:

Швидкість потоку рухомої фази 1 см 3 /хв;

Довжина хвилі збудження флуоресценції.........330 нм;

Довжина хвилі реєстрації флуоресценції.........460 нм;

Об'єм дозування........................................20 мм 3 .

6.4.4 Градуювання хроматографа

Якщо застосовують колонку за 6.3.11.2 і рухому фазу за 6.2.10, то хроматографічний аналіз.

Градуювання хроматографа проводять при освоєнні методики і надалі у всіх випадках, коли змінюються умови хроматографічного аналізу.

Вводять у хроматограф щонайменше чотири градуювальні розчини з різними значеннями масової концентрації охратоксину А (див. 6.2.16). Обсяг дозування кожного градуювального розчину повинен бути одним і тим же.

Встановлюють градуювальну характеристику як залежність площі або висоти піку від маси охратоксину А в об'ємі, що інжектується.

Перевіряють лінійність встановленої градуювальної характеристики, використовуючи коефіцієнт кореляції (див. 5.3.7). Щодня перед початком роботи проводять контроль стабільності градуювальної характеристики аналогічно 5.3.8, використовуючи при цьому градуювальний розчин охратоксину А масової концентрації 25 нг/см 3 (див. 6.2.16).

6.4.5 Ідентифікація охратоксину А

Пік охратоксину А ідентифікують шляхом порівняння значень часу утримання піків на хроматограмі проби та градуювальних розчинів. У деяких випадках може знадобитися введення проби з добавкою розчину охратоксину А в рухомій фазі (див. 5.4.4).

6.4.6 Кількісне визначення

Підготовлений 6.4.2 розчин проби відразу ж вводять в хроматограф. Обсяг дозування повинен дорівнювати обсягу дозування градуювальних розчинів при проведенні градуювання хроматографа (див. 6.4.4).

Вимірюють площу або висоту піку охратоксину А на хроматограмі проби і за допомогою градуювальної характеристики (див. 6.4.4) знаходять його масу (/n-i, нг) в об'ємі, що інжектується.

Якщо значення відгуку охратоксину А на хроматограмі проби виходить за межі градуювальної характеристики, підготовлений розчин проби розбавляють або концентрують перед введенням в хроматограф, враховуючи цей факт при розрахунку результатів вимірювань по 6.5.

6.4.7 Підтвердження

При необхідності підтверджують ідентифікацію піку охратоксину А за його зникненням і одночасною появою піку з часом утримування, що збігається з часом утримання піку метилового ефіру охратоксину А в результаті дериватизації бору.

Відбирають 0,5 см 3 розчину, приготованого по 6.4.2, в гостродонну колбу, випарюють до сухого залишку на ротаційному випарнику (див. 5.2.7). Сухий залишок розчиняють в 1 см 3 хлористого метилену (див. 6.2.4) і додають 2 см 3 розчину бору трифториду в метанолі (див. 6.2.12).

Колбу щільно закривають пробкою і нагрівають на водяній бані при температурі від 50 до 60 °С протягом 15 хв. Після охолодження розчин переносять у ділильну лійку місткістю 50 см 3 містить 30 см 3 води, струшують по 30 з трьома порціями хлористого метилену по 10 см 3 кожна. Об'єднують органічні фази після кожної екстракції в іншій ділильній лійці місткістю 50 см 3 додають для промивання 20 см 3 води і струшують протягом 30 с.

Фільтрують органічну фазу через шар безводного сірчанокислого натрію (див. 5.2.14) в гостродонну колбу, упарюють до сухого залишку, розчиняють в 500 мм 3 рухомої фази (див. 6.2.10) і реєструють хроматограму отриманого розчину в умовах 6.

Для знаходження часу утримання метилового ефіру охратоксину А та перевірки повноти дериватизації у зазначених вище умовах проводять обробку проміжного розчину 6.2.15.

6.5 Обробка результатів випробувань

Масову частку охратоксину А X, млн" 1 обчислюють за формулою

де Vi - обсяг толуолу, взятий для екстракції 6.4.2, см 3 (100 см 3);

3 - обсяг розчину проби, підготовленого по 6.4.2, см 3 (1 см 3);

mi - маса охратоксину А, встановлена ​​за 6.4.6, нг;

V 2 - обсяг аліквоти центрифугату 6.4.2, см 3 (50 см 3);

V 4 - обсяг дозування підготовленого розчину проби, см 3;

/77- маса проби, взятої для випробувань, г;

10" 3 - коефіцієнт узгодження розмірності одиниць маси.

6.6 Метрологічні характеристики

6.6.1 Результати міжлабораторних випробувань з визначення точності методу, проведених відповідно до ГОСТ ISO 5725-2 , наведені в Додатку Б. додатку Б.

6.6.2 Абсолютна розбіжність між двома результатами одиничних випробувань, отриманими в умовах повторюваності, може перевищувати межу повторюваності не більше ніж у 5 % випадків.

Значення меж повторюваності г при аналізі пшеничного борошна із цільного зерна:

/=0,18 мкг/кг (0,00018 млн" 1) при Х=0,41 мкг/кг (0,00041 млн" 1);

/=0,70 мкг/кг (0,00070 млн" 1) при X =1,23 мкг/кг (0,00123 млн" 1).

6.6.3 Абсолютна розбіжність між двома результатами одиничних випробувань, отриманими в умовах відтворюваності, може перевищувати межу відтворюваності R не більше ніж у 5 % випадків.

Значення меж відтворюваності R під час аналізу пшеничного борошна з цільного зерна: R=0,30 мкг/кг (0,00030 млн" 1) при Х=0,41 мкг/кг (0,00041 млн" 1);

R=1,10 мкг/кг (0,00110 млн" 1) при X =1,23 мкг/кг (0,00123 млн" 1).

6.7 Контроль якості результатів вимірів – по 5.7.

6.8 Оформлення результатів випробувань – по 5.8.

Додаток А (довідковий)

Приклад хроматограми

А.1 На малюнку А.1 наведено приклад хроматограми (метод А) концентрату стандартного зразка OW-815 «Охратоксин А в меленій пшениці», виготовленого компанією R-Biopharm Rhone Ltd. з масовою часткою охратоксину А (0,0049 + 0,0010) млн" 1 .

4 6 8 10 12 14 16 Час, хв

Малюнок А.1 - Приклад хроматограми 2 3

Додаток Б (довідковий)

Дані щодо прецизійності

Б.1 Наведені в таблиці Б.1 дані отримані в результаті міжлабораторних випробувань, проведених для методу Б відповідно до ГОСТу ISO 5725-2 Інституту імені Макса фон Петтенкофера (Берлін, Німеччина) на пробах пшеничного борошна.

Таблиця Б.1 - Дані щодо прецизійності методики

Найменування Борошно пшеничне Борошно пшеничне показника Число лабораторій Число проб Число лабораторій, що залишилися після виключення викидів Число викидів Число прийнятих результатів Середнє значення X, мкг/кг Стандартне відхилення повторюваності s r , мкг/кг Відносне стандартне відхилення повторюваності RSD r Межа повторюваності г, мкг/кг Стандартне відхилення відтворюваності s R , мкг/кг Відносне стандартне відхилення відтворюваності RSD r Межа відтворюваності R, мкг/кг

УДК 543.544.5.068.7:006.354 МКС 67.060 NEQ

Ключові слова: зерно, продовольче зерно, зерно фуражне, комбікорми, продукти переробки зерна, методи випробувань, хроматографія, високоефективна рідинна хроматографія, охратоксин А, мікотоксини

Підписано до друку 14.04.2016. Формат 60x84V 8 .

Уел. піч. л. 2,33. Тираж 22 екз. Зак. 1070.

Підготовлено на основі електронної версії, наданої розробником стандарту

ФГУП «СТАНДАРТИНФОРМ»

123995 Москва, Гранатний пров., 4. www.gostinfo.ru [email protected]

СТАНДАРТ ЗЕРНО ТА ПРОДУКТИ ЙОГО ПЕРЕРОБКИ, КОМБІКОРМА Визначення охратоксину А методом високоефективної рідинної хроматографії

МІЖДЕРЖАВНИЙ

Grain and products of its processing, mixed feeds.

Визначення ochratoxin A висока ефективність хімічної хроматографії

Дата введення - 2015-07-01

1 Область застосування

Цей стандарт поширюється на зерно та продукти його переробки та встановлює методи визначення вмісту охратоксину А із застосуванням високоефективної рідинної хроматографії (далі - ВЕРХ) з флуориметричним детектуванням із застосуванням:

Скринінгу проб та очищення методом колонкової хроматографії (метод А) у продовольчому зерні, борошномельно-круп'яних виробах на основі пшениці, кукурудзи, ячменю, жита, вівса та рису, комбікормів та сировини для їх виробництва на зерновій основі (макуха, шрот) масової частки охратоксину А від 0,0025 до 1,0 млн" 1;

Очищення методом твердофазної екстракції (метод Б) у зерні злаків та муці в діапазоні вимірювань масової частки охратоксину А більше 0,0004 млн" 1 .

Примітка -1 млн"1 відповідає 1 мг/кг або 1000 мкг/кг.

2 Нормативні посилання

У цьому стандарті використано нормативні посилання на такі стандарти:

З об'єднаної проби виділяють лабораторну пробу масою не менше 100 г, яку розмелюють до такого стану, щоб вона проходила через сито розміром діаметра отворів 1 мм. Виділену розмелену лабораторну пробу ретельно перемішують і зберігають до проведення випробувань у сухому темному місці в посудині під кришкою.

Проби борошна випробовують без розмелювання.

4 Вимоги безпеки

При проведенні вимірювань слід дотримуватись вимог:

Електробезпеки відповідно до ГОСТ 12.1.019 та технічної документації на хроматограф;

Вибухобезпеки відповідно до ГОСТ 12.1.010;

Пожежної безпеки відповідно до ГОСТ 12.1.004;

Безпеки під час роботи зі шкідливими речовинами відповідно до ГОСТ 12.1.007.

ПОПЕРЕДЖЕННЯ - Охратоксин А викликає ураження нирок та печінки і імовірно є канцерогеном. Усі роботи, пов'язані з підготовкою проби та приготуванням розчинів охратоксину А, слід проводити у витяжній шафі з використанням захисного одягу, рукавичок та захисних окулярів. Деконтамінацію скляного посуду, що контактувала з охратоксином А, проводять 4% розчином гіпохлориту натрію.

5 Метод А

5.1 Сутність методу

Метод заснований на екстракції охратоксину А з аналізованої проби продукту підкисленим хлороформом, скринінгу проб, які можуть містити охратоксин А, очищення їх екстрактів методом колонкової хроматографії на силікагелі та визначенні масової частки охратоксину А із застосуванням ВЕРХ з флуориметричним.

5.2 Засоби вимірювання, допоміжне обладнання, стандартні зразки, реактиви, посуд та матеріали

5.2.1 Хроматограф рідинний з флуориметричним або спектрофлуориметричним детектором, що забезпечує збудження флуоресценції в спектральній області (330 + 20) нм і регі-

цію інтенсивності флуоресценції в спектральній області (465 ± 20) нм. Застосовуваний детектор повинен забезпечувати межу виявлення охратоксину А не більше 5 нг/см 4 5

5.2.2 Ваги неавтоматичної дії за ГОСТ OIML R 76-1-2011 з межами абсолютної похибки, що допускається, не більше ± 0,01 г.

5.2.3 Колонка хроматографічна аналітична, заповнена обернено-фазовим сорбентом зерненням 5 мкм, що має ефективність не менше 5000 теоретичних тарілок з піку охратоксину А*.

5.2.4 Передколонка того ж внутрішнього діаметра і заповнена тим самим обернено-фазовим сорбентом, що і аналітична колонка.

5.2.5 хроматографічна колонка скляна з пришліфованою пробкою довжиною 200 мм і внутрішнім діаметром 10 мм.

5.2.6 Подрібнювач проб, що забезпечує подрібнення до частинок розміром менше 1 мм, наприклад лабораторний млин.

5.2.7 Випарник ротаційний типу ІР-1 М2 або аналогічний, з водяною лазнею з регулятором температури в діапазоні від 20 °С до 50 °С.

5.2.8 Пристрій перемішування проб (шейкер), що забезпечує частоту струшування до 120 хв" 1 .

5.2.9 Насос лабораторний вакуумний, мембранний або водоструминний за ГОСТ 25336, що забезпечує розрідження від 2,5 до 10 кПа.

5.2.10 Шафа сушильна, що забезпечує температуру до 200 °С.

5.2.12 Стандартний зразок складу розчину охратоксину А в ацетонітрилі масової концентрації 50 мкг/см 5 з допустимою похибкою ± 2,5 мкг/см 5 . Допускається застосування

стандартних зразків складу розчину охратоксину А в інших розчинниках, що має бути враховано при приготуванні вихідного розчину 5.3.3.1.

5.2.13 Вода дистильована згідно з ГОСТ 6709 або вода для лабораторного аналізу ступеня чистоти 1 згідно з ГОСТом ISO 3696 .

5.2.22 Піпетки градуйованих типів 1-3 виконань 1(1а) або 2(2а) 2-го класу точності місткістю 1,2, 5 см 5 за ГОСТ 29227 .

5.2.23 Циліндри мірні виконань 1-4 2-го класу точності місткістю 25, 50, 250 см 5 за ГОСТ 1770 .

5.2.24 Колби мірні 2-25-2, 2-50-2, 2-100-2, 2-500-2 за ГОСТ 1770 .

5.2.25 Колби гостродонні 0-10-14/23 та 0-50-14/23 за ГОСТ 25336.

5.2.26 Плоскодонні колби типу П-1 або Кн-1 місткістю 50, 100, 250 см 5 за ГОСТ 25336 .

5.2.27 Дозатори піпеткові одноканальні змінного об'єму від 100 до 1000 мм 5 з метрологічними характеристиками згідно з ГОСТ 28311 .

5.2.28 Вирви лабораторні типу В згідно з ГОСТ 25336.

5.2.30 Пробірка для мікропроб одноразового застосування (типу Епендорф) місткістю

5.2.31 Скляні ємності місткістю 50, 250, 1000 см 5 з пришліфованими скляними, фторопластовими або поліетиленовими пробками.

5.2.32 Сито з діаметром отворів 1,0 мм.

5.2.33 Палички скляні.

5.2.34 Годинник пісочний або таймер.

5.2.35 Фільтри паперові "червона стрічка".

5.2.37 Силікагель для колонкової хроматографії розміром частинок від 100 до 200 мкм. Допускається застосування інших засобів вимірювань з метрологічними характеристиками

гірше вищезазначених та допоміжного обладнання та матеріалів з технічними характеристиками не гірше за вищевказані.

5.3 Підготовка до проведення випробувань

5.3.1 Підготовка скляного посуду

Посуд для приготування та зберігання рухомої фази миють тільки сірчаною кислотою по 5.2.20 (без застосування інших миючих засобів), ретельно промивають водопровідною водою та обполіскують дистильованою водою.

Решту скляного посуду миють гарячою водою з миючим засобом, ретельно обполіскують дистильованою водою і сушать у сушильній шафі при температурі 105 °С.

5.3.2 Приготування допоміжних розчинів

5.3.2.1 Приготування рухомої фази

У мірну колбу місткістю 500 см 3 з щільно закривається пришліфованою скляною, фторопластовою або поліетиленовою пробкою поміщають 5 см 3 крижаної оцтової кислоти (див. 5.2.15), 215 см 3 ацетонітрилу (див. 5.2). Суміш ретельно перемішують. Неприпустимий контакт рухомої фази з гумою.

Термін зберігання суміші при кімнатній температурі – не більше 1 міс.

5.3.2.2 Приготування розчину оцтової кислоти об'ємною часткою 1 %

У плоскодонну колбу місткістю 250 см 3 поміщають 200 см 3 дистильованої води та 2 см 3 крижаної оцтової кислоти (див. 5.2.15) і ретельно перемішують.

Термін зберігання розчину при кімнатній температурі в скляній ємності із щільно закривається пришліфованою скляною, фторопластовою або поліетиленовою пробкою - не більше 1 міс.

5.3.2.3 Приготування суміші хлороформу та мурашиної кислоти в об'ємному співвідношенні

У плоскодонну колбу місткістю 250 см 3 поміщають 200 см 3 хлороформу (див. 5.2.18) та 4 см 3 мурашиної кислоти (див. 5.2.19). Додають 10 г безводного сірчанокислого натрію (див. 5.2.14). Суміш ретельно перемішують, фільтрують через фільтр «червона стрічка».

Термін зберігання суміші при кімнатній температурі у скляній ємності з пришліфованою скляною, фторопластовою або поліетиленовою пробкою – не більше 1 міс.

5.3.3 Приготування розчинів охратоксину А

5.3.3.1 Приготування вихідного розчину охратоксину А з масовою концентрацією

Піпеткою відбирають 1 см 3 стандартного зразка складу розчину охратоксину А в ацетонітрилі масової концентрації 50 мкг/см 3 (див. 5.2.12), поміщають у мірну колбу місткістю 50 см 3 і доводять об'єм до мітки ацетонітрилом (1).

Термін зберігання приготовленого розчину в холодильнику при температурі від 2 до 6°С - не більше 6 міс.

При використанні стандартного зразка складу розчину охратоксину А в інших розчинниках аліквоту (1 см 3) упарюють до сухого залишку у вакуумі при температурі водяної лазні від 40 до 45 °С або в струмі азоту. Сухий залишок розчиняють 2 см 3 ацетонітрилу і перемішують 1 хв. Потім отриманий розчин кількісно переносять у мірну колбу місткістю 50 см 3 і розбавляють до мітки ацетонітрилом.

Примітка - Допускається приготування вихідного розчину охратоксину А 6.2.14 -6.2.15 з використанням ацетонітрилу замість рухомої фази 6.2.10.

5.3.3.2 Приготування розчину охратоксину А в ацетонітрилі з масовою концентрацією 100

У мірну колбу місткістю 50 см 3 поміщають 5 см 3 розчину охратоксину А з масовою концентрацією 1 мкг/см 3 по 5.3.3.1, що відповідає 1000 нг/см 3 і доводять об'єм до мітки рухомою фазою по 5.3.2.1.

Термін зберігання отриманого розчину в холодильнику при температурі від 2 до 6°С - не більше 3 міс.

5.3.3.3 Приготування градуювальних розчинів охратоксину А

Вихідний розчин охратоксину А в ацетонітрилі по 5.3.3.1 поміщають у мірну колбу місткістю 50 см 3 . Об'єм розчину охратоксину А повинен відповідати вимогам таблиці 1.

Таблиця 1

розчину	Об'єм вихідного розчину по 5.3.3.1, см 3	Номінальне значення масової концентрації, нг/см 3

Вміст колби розбавляють до мітки рухомою фазою 5.3.2.1 відповідно до таблиці 1.

Термін зберігання градуювальних розчинів – не більше семи днів.

Примітка - При необхідності допускається приготування аналогічним способом розчинів охратоксину А інших концентрацій у діапазоні лінійності градуювальної характеристики (див. 5.3.7).

5.3.3.4 Усі розчини охратоксину А зберігають у холодильнику при температурі не вище 6 °С або в морозильній камері при температурі не вище мінус 18 °С у скляних або фторопластових судинах.

Фактичне значення масової концентрації охратоксину А в розчинах 5.3.3.1 - 5.3.3.3 обчислюють, виходячи зі значень масової концентрації охратоксину А за паспортом стандартного зразка.

Перед використанням витримують розчини до досягнення кімнатної температури.

5.3.4 Підготовка скляної хроматографічної колонки

Скляну хроматографічну колонку готують безпосередньо перед проведенням випробування.

У склянку місткістю 50 см 3 поміщають (1,0 ± 0,1) г силікагелю (див. 5.2.37), додають від 10 до 15 см 3 хлороформу (див. 5.2.18) і ретельно перемішують. Отриману суспензію витримують у склянці протягом 4-5 хв і потім кілька прийомів через воронку діаметром 25 або 36 мм переносять суспензію силікагелю в колонку, попередньо помістивши на її дно шматочок вати.

Після осідання силікагелю в колонці зверху насипають шаром близько 2 г безводного сірчанокислого натрію (див. 5.2.14).

У процесі роботи з колонкою не можна допускати висихання сорбенту, для чого необхідно підтримувати над осушувачем шар розчинника. У стані готовності колонка повинна бути заповнена хлороформом вище за рівень сорбенту, закрита скляною пришліфованою пробкою, а вихід колонки повинен бути занурений у хлороформ.

Підготовлену колонку використовують одноразово.

5.3.5 Підготовка хроматографа

Підготовку хроматографа до вимірювань проводять відповідно до керівництва (інструкції) з експлуатації.

Встановлюють робочі довжини хвиль збудження та реєстрації флуоресценції (див. 5.2.1). Швидкість подачі рухомої фази задають залежно від типорозмірів колонки, керуючись вказівками виробника хроматографа та колонки. Наприклад, для колонки, зазначеної в 5.2.3, рекомендована об'ємна швидкість рухомої фази становить 200 мм3/хв. За наявності термостата колонок встановлюють температуру (25±1) °С.

5.3.6 Умови хроматографічного аналізу

Якщо використовують хроматографічну колонку 5.2.3 і рухому фазу 6.2.10, то хроматографічний аналіз проводять у наступних умовах:

Довжина хвилі збудження флуоресценції 330 нм;

Довжина хвилі реєстрації флуоресценції 465 нм;

Швидкість потоку рухомої фази.......................200 мм 3 /хв;

Обсяг дозування................................................ 20 мм 3;

Температура термостата колонки (за його наявності)...(25±1) °С.

При використанні колонок інших типорозмірів швидкість потоку рухомої фази та обсяг дозування вибирають відповідно до вказівок виробника хроматографа і колонки.

5.3.7 Градуювання хроматографа

Діапазон лінійності градуювальної характеристики становить від 10 до 100 нг/см3. Як зразки для градуювання хроматографа використовують градуювальні розчини охратоксину А 5.3.3.3.

Реєструють не менше двох хроматограм кожного градуювального розчину і проводять градуювання хроматографа, встановлюючи параметри градуювальної характеристики та час утримання охратоксину А, використовуючи програмне забезпечення до хроматографа.

Розраховують коефіцієнт кореляції та відхилення розрахованих значень масової концентрації охратоксину А в кожній градуювальній точці від фактичного значення відповідно до процедури приготування градуювальних розчинів (див. 5.3.3.3).

Градуювання вважають прийнятним, якщо:

Коефіцієнт кореляції щонайменше 0,998;

Відносне відхилення розрахованого значення масової концентрації охратоксину від фактичного значення не більше + 10 %. Замість відносного відхилення прийнятність градуювальної характеристики може бути оцінена за відносним стандартним відхиленням, яке не повинно перевищувати 5 %.

5.3.8 Контроль стабільності градуювальної характеристики

Контроль стабільності градуювальної характеристики проводять щодня перед початком

Як контрольний розчин використовують розчин охратоксину А в рухомій фазі, приготовлений аналогічно 5.3.3.3. Масову концентрацію охратоксину А в контрольному зразку вибирають, виходячи з передбачуваного вмісту охратоксину А у випробуваних пробах; рекомендується використання розчину охратоксину масової концентрації 20 нг/см.

Реєструють не менше двох хроматограм контрольного розчину та ідентифікують пік охратоксину А за часом утримування при ширині вікна ідентифікації 5 %, вносячи за необхідності програмну корекцію часу утримання піку, і за допомогою градуювальної характеристики розраховують масову концентрацію охратоксину А для кожного введення.

Збіжність значень часу утримання та значень масової концентрації охратоксину А перевіряють за формулами:

де U та t 2 - час утримування піку охратоксину А на першій та другій хроматограмах відповідно, хв;

I - середньоарифметичне значення U і t 2 хв.

Ск: і «2 - масові концентрації охратоксину А в контрольному розчині по першій і другій хроматограм відповідно, нг/см 3 ;

С к - середньоарифметичне значень С К: і С ю, нг/см 3 .

Градуювальна залежність визнається стабільною, якщо виконується умова

де С - масова концентрація охратоксину А в контрольному розчині, нг/див.

Якщо умова (3) не виконується, процедуру контролю повторюють. Результати повторного контролю вважають остаточними, і градуювання хроматографа 5.3.7 проводять заново.

Примітка - Повторне градуювання хроматографа, як правило, потрібне при зміні ефективності хроматографічної системи або чутливості детектора (наприклад після ремонту або тривалого простою хроматографа).

5.3.9 Контроль холостої реактивної проби

Випробування холостої реактивної проби проводять перед випробуванням досліджуваних проб.

У плоскодонну колбу місткістю 50 см 3 поміщають 30 см 3 хлороформу і 2,5 см 3 розчину оцтової кислоти по 5.3.2.2, ретельно перемішують і обережно відбирають з нижнього шару 20 см 3 потрапляння до неї води.

Остродонну колбу поміщають у ротаційний випарник і упарюють у вакуумі до сухого залишку при температурі водяної лазні від 40 до 45 °С. Продовжують виконувати всі операції 5.4.3, отримуючи таким чином концентрат холостої проби. Проводять хроматографічне дослідження отриманого концентрату 5.4.4. Якщо на хроматограмі є піки, за часом утримування близькі до піку охратоксину А, то знаходять і усувають причини забруднення холостої проби (реактиви або посуд).

Найбільш поширеною причиною незадовільного результату контролю холостої проби є недостатня чистота хлороформу, який може бути забруднений домішками, що мають близькі до охратоксину А значення часу утримування. Такий хлороформ необхідно замінити або піддати ретельній перегонці, збираючи середню фракцію з температурою кипіння від 60 °С до 62 °С.

5.3.10 Врахування втрат охратоксину А в процесі підготовки проб

У плоскодонну колбу місткістю 50 см 3 поміщають 30 см 3 хлороформу (див. 5.2.18) і 2,5 см 3 розчину оцтової кислоти (див. 5.3.2.2), вносять 0,25 см 3 розчину охратоксину А в ацетонітрилі мас. /див 3 (див. 5.3.3.2). Ретельно перемішують і обережно відбирають 20 см 3 хлороформного (нижнього) шару в гостродонну колбу для упарювання місткістю 50 см 3 не допускаючи потрапляння в неї води. Упарюють до сухого залишку у вакуумі при температурі водяної лазні від 40 до 45 °С.

Далі продовжують виконувати всі операції 5.4.3, проводять хроматографічний аналіз отриманого концентрату 5.4.4 і, використовуючи градуювальну характеристику 5.3.7, обчислюють масову концентрацію охратоксину А в концентраті.

Потім обчислюють коефіцієнт проходження охратоксину А п за формулою

(4)

V 0 - об'єм розчину охратоксину А 5.3.3.2, відібраний для приготування контрольного

зразка, см 3 (0,25 см 3).

Коефіцієнт проходження охратоксину А визначають не менше трьох разів на стадії освоєння методики і потім зміні партій реактивів. Отримані значення повинні відповідати таким вимогам:

Кожне з одержаних значень не менше 0,7;

Відносне значення розмаху набутих значень відповідає умові

I макс Умін I q jq ^

де Дмакс і т | хв - найбільше та найменше з отриманих значень коефіцієнта проходження охратоксину А;

г) - середньоарифметичне отриманих значень коефіцієнта проходження охратоксину

Якщо обидві ці умови виконуються, то середньоарифметичне значення коефіцієнта проходження охратоксину А використовують при розрахунку результатів визначення за формулою (9). В іншому випадку знаходять причини втрат охратоксину А та повторюють визначення коефіцієнта проходження.

Примітки

1 Причиною незадовільного результату визначення коефіцієнта проходження може бути підвищена швидкість проходження елюентів через колонку.

2 Слід звернути особливу увагу на необхідність визначення коефіцієнта проходження охратоксину при зміні партії силікагелю. Рекомендується при переході до нової партії силікагелю провести оптимізацію обсягів елюентів, що використовуються при колонковому очищенні проб (див.5.4.3), досягаючи найбільшого значення коефіцієнта проходження. Знайдені при цьому обсяги використовують для очищення проб на колонках, виготовлених з цієї партії реагенту.

3 Рекомендується уточнити для конкретних матриць коефіцієнт проходження охратоксину А з використанням стандартних зразків складу продукції з атестованим значенням масової частки охратоксину А або шляхом аналізу «чистої» проби (охратоксин А в пробі не виявляється), в яку внесена добавка охратоксину А. пробу з добавкою охратоксину А) згідно з 5.4.1 - 5.4.4. Обчислюють результат аналізу (див. 5.5) і знаходять коефіцієнт проходження охратоксину А як відношення отриманого результату до атестованого значення масової частки охратоксину А в стандартному зразку або масовій частці охратоксину А в добавці.

5.4 Проведення випробувань

5.4.1 Екстракція охратоксину А з проби

Пробу подрібненого продукту масою (5,00 ± 0,01) г поміщають у плоскодонну колбу місткістю 100 см 3 . Додають 30 см 3 хлороформу (див. 5.2.18) та 2,5 см 3 розчину оцтової кислоти (див. 5.3.2.2), інтенсивно перемішують 30 хв. Пропускають отриманий екстракт через паперовий складчастий фільтр червона стрічка, відбираючи 20 см 3 фільтрату для упарювання.

Якщо не вдається відібрати 20 см 3 фільтрату, то відбирають максимально можливий об'єм, вимірюють його та використовують отримане значення у формулі (9).

Переносять отриманий фільтрат в гостродонну колбу місткістю 50 см 3 і упарюють до сухого залишку у вакуумі при температурі водяної лазні від 40 до 45 °С.

Сухий залишок обробляють по 5.4.2 або 5.4.3 залежно від мети випробування - скринінгом проб або кількісним визначенням масової частки охратоксину А в пробі, в якій при скринінгу виявлено пік, ідентифікований пік охратоксину А.

Примітка - При випробуваннях проб, для яких є підстави вважати, що вони заражені охратоксином А, дозволяється відразу переходити до очищення на колонці 5.4.3, минаючи скринінг.

5.4.2 Проведення скринінгу проб

Сухий залишок, отриманий 5.4.1, розчиняють в 0,5 см 3 рухомий фази 5.3.2.1 і перемішують 1 хв. Потім додають 3 см 3 гексану (див. 5.2.17) і знову інтенсивно перемішують. Після розшарування двох фаз, що не змішуються між собою, акуратно переносять приблизно 0,3 см 3 нижнього шару в пробірку для мікропроб одноразового застосування місткістю 1,5 см 3 (пробірка типу Еппендорф) або аналогічну.

Реєструють хроматограму отриманого розчину 5.4.4 в день проведення випробувань. Якщо на хроматограмі виявляють пік, що ідентифікується програмним забезпеченням до хроматографа як пік охратоксину А, повторюють випробування проби, включивши в обов'язковому порядку очищення за 5.4.3.

За відсутності піку, що ідентифікується як пік охратоксину А, роблять висновок про відсутність охратоксину А в пробі на рівні нижньої межі діапазону вимірювань (0,0025 млн. 1).

5.4.3 Очищення проби та приготування її концентрату

Сухий залишок по 5.4.1 розчиняють 1 см 3 хлороформу.

Готують скляну колонку 5.3.4. Дають хлороформу стекти рівня безводного сірчанокислого натрію і наносять на колонку отриманий розчин. Остродонну колбу, в якій проводили упарювання екстракту, обполіскують двічі по 1 см 3 хлороформу, який також наносять на колонку. Після цього промивають колонку 10 см 3 гексану, елюат відкидають.

Потім через колонку пропускають 30 см 3 суміші хлороформу з мурашиною кислотою (див. 5.3.2.3) зі швидкістю не більше однієї краплі в секунду, елююючи охратоксин А. Весь елюат збирають в гостродонну колбу і упарюють до сухого залишку у вакуумі при температурі водяної бані від 40 до 45 °С.

Сухий залишок розчиняють 0,5 см 3 рухомої фази (див. 5.3.2.1) і перемішують 1 хв. Потім додають 3 см 3 гексану і знову інтенсивно перемішують. Після розшарування двох фаз, що не змішуються між собою, акуратно переносять приблизно 0,3 см 3 нижнього шару в пробірку для мікропроб одноразового застосування місткістю 1,5 см 3 (пробірка типу Еппендорф) або аналогічну. Отриманий концентрат використовують для хроматографічних вимірювань 5.4.4 в день проведення випробувань.

Наприклад, колонка Lichrospher® 100 RP 18 є прикладом комерційного продукту, що задовольняє зазначеним вимогам. Ця інформація наведена для зручності користувачів цього стандарту та не є підтримкою вказаного продукту.

Пік відповідає вмісту охратоксину А, що дорівнює 0,0042 млн".

* Приклад комерційного продукту, що задовольняє зазначеним вимогам - хроматографічна колонка внутрішнім діаметром 2,1 мм і довжиною 120 мм, заповнена звернено-фазовим сорбентом Кромасил С-18 з розміром частинок 5 мкм, з передколонкою довжиною 25 мм. Ця інформація наведена для зручності користувачів цього стандарту та не є підтримкою вказаного продукту.

Охратоксини виробляються деякими видами грибів Aspergillusі Penicillium. Основними продуцентами є A.ochraceusі P.viridicatum. Ці гриби зустрічаються повсюдно. Aspergillusвиробляє охратоксини при підвищеній температурі та вологості, а Penicilliumвже за 5ºС. Охратоксини – сполуки високої токсичності, з яскраво вираженим тератогенним ефектом.

Охратоксини А,В, і С є групою близьких за структурою сполук, що є ізокумаринами, пов'язаними з L-фенілаланіном пептидним зв'язком. Залежно від природи радикалів утворюються охратоксини різних типів (табл. 2.3).

Охратоксин А – безбарвна кристалічна речовина, що слабо розчиняється у воді, помірно розчинна у полярних органічних розчинниках (метанол, хлороформ), а також у водному розчині карбонату натрію. У хімічно чистому вигляді він нестабільний і дуже чутливий до впливу світла та повітря, однак у розчині етанолу може зберігатися без змін протягом тривалого часу. В УФ світлі має зелену флуоресценцію.

Охратоксин В – кристалічна речовина, аналог охратоксину А, що не містить атом хлору. Він приблизно в 50 разів менш токсичний, ніж охратоксин А. В УФ-світлі має блакитну флуоресценцію.

Охратоксин С – аморфна речовина, етиловий ефір охратоксину А, близький до нього за токсичністю, але як природний забруднювач харчових продуктів і кормів не виявлений. У У-світлі має блідо-зелену флуоресценцію.

Охратоксини належать до токсичних мікотоксинів, мають високу токсичність для печінки, нирок, тератогенними та імунодепресивними властивостями, вираженим гемолітичним ефектом. З охратоксинів найбільш токсичний охратоксин А (ЛД 50 = 3,4 мг/кг, (одноденні курчата, перорально)). Він токсичніший, ніж афлатоксини. Інші мікотоксини цієї групи значно менш токсичні.

Біохімічні, молекулярні, клітинні механізми дії охратоксинів вивчені недостатньо. Відомо, що охратоксин А пригнічує синтез протеїну та метаболізм вуглеводів, зокрема гліконогеноз шляхом інгібування активності фенілаланін – т-РНК – специфічного ферменту, що грає ключову роль у початковій стадії синтезу протеїну.

Охратоксин А виявлений у кукурудзі, ячмені, пшениці, вівсі, ячмені. Важливим і небезпечним є той факт, що при високому забрудненні кормового зерна та комбікормів охратоксин А виявляється у тваринницькій продукції (шинка, бекон, ковбаси). Охратоксин зустрічається рідко. Охратоксини також вражають усі плоди садово-городніх культур. Особливо сильно уражаються яблука: до 50% урожаю може забруднюватись мікотоксинами.

Слід зазначити, що охратоксини є стабільними сполуками. Так, наприклад, при тривалому прогріванні пшениці, забрудненої охратоксином А, його вміст знижувався лише на 32% (при температурі 250–300ºС). Таким чином, поширеність у продуктах харчування, токсичність та стійкість охратоксинів створюють реальну небезпеку для здоров'я людини.

Методи аналізу

Охратоксин А міститься в окислених продуктах. Він легко розчиняється у багатьох органічних розчинниках, що використовується для екстракції. Найбільш часто використовується екстракція хлороформом і водним розчином фосфорної кислоти з подальшим очищенням на колонці і кількісне визначення з використанням методу ТШХ.

Розроблено також метод ВЕРХ. Перед ВЕРХ аналізом зразок готують так. Подрібнений зразок обробляють сумішшю 2 М соляної кислоти та 0,4 М розчину хлориду магнію. Після гомогенізації екстрагують толуолом протягом 60 хв. Суміш центрифугують. Центрифугат пропускають через колонку з силікагелем та промивають сумішшю толуолу з ацетоном (рухлива фаза). Охратоксин А елююється сумішшю толуолу з оцтовою кислотою (9:1) та висушується при 40°С. Залишок розчиняють та фільтрують. Аналіз проводять з використанням ВЕРХ.

Крім того, розроблено низку біопроб на креветках, бактеріях, але отримані результати не дозволили використовувати ці методи для визначення охратоксинів.



Концентрація охратоксину А в пробі, мг/кг

Межі відносної похибки (показник точності) (±d), %, Р = 0,95

Стандартне відхилення повторюваності (s r), %

Межа повторюваності ( r), %

Повнота вилучення речовин, %

4.2. Допоміжне обладнання

Апарат для струшування проб типу АВУ-6С або аналогічний
Ротаційний випарник ІР-1М з пасткою або аналогічний
Електрошафа сушильна лабораторна з похибкою підтримання температури ±2,5 в інтервалі від 50 до 350 °С
Холодильник побутовий
Млин лабораторний електричний ЕМ-3А або аналогічний рН-метр	ТУ 46-22-236-79
Магнітна мішалка типу ММ 5 з стрижнем, що перемішує.	ТУ 25-11.834-80
Колби плоскодонні конічні на 250 см3 з НШ 29, тип КНКШ 250-29/32	ГОСТ 10394-74
Флакони скляні, що загвинчуються з темного скла (вайл), об'ємом 7 см3
Колби мірні, місткістю 100, 500, 1000 см3 тип 2-100-2,2-500-2
Вирви лабораторні
Колби грушоподібні на 10 см3 з НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23	ГОСТ 10394-72

4.3. Реактиви та матеріали

. Підготовка до виконання вимірювань

5.1. Приготування стандартних розчинів охратоксину А

Для приготування стандартного розчину зберігання (концентрація охратоксину А - 10 нг/мкл) навішування кристалічного охратоксину А масою 5 мг поміщають у мірну колбу об'ємом 500 см3, доливають 50 см3 суміші толуол-оцтова кислота (98:2 % об.), ретельно перемішують. повного розчинення речовини та доводять тією ж сумішшю розчинників до мітки. Для точної концентрації розчину зберігання вимірюють його оптичну щільність при довжині хвилі 333 нм (Д333). Концентрацію розчину обчислюють за такою формулою:

Для приготування робочих розчинів охратоксину з концентрацією 0,005; 0,05 та 0,1 нг/мкл відбирають відповідно 50, 500 та 1000 мкл розчину з концентрацією 0,5 нг/мкл, упарюють насухо і розчиняють у 5 см3 рухомої фази.

Розчин зберігання охратоксину А містять у скляному посуді з притертою пробкою в темному прохолодному місці (при температурі близько 0 ° С) до одного року і використовують для приготування робочих стандартних розчинів. Робочі стандартні розчини зберігають у вайлах із темного скла у темному прохолодному місці (при температурі близько 0 °С) протягом 1 місяця.

Перед використанням робочих стандартних розчинів їх довести до кімнатної температури і тільки після цього слід відкривати пробки.

5.2. Приготування буферного фосфатного розчину, рН = 7,4

Наважку натрію фосфорнокислого двозаміщеного 12-водного масою 1,15 г, навішування однозаміщеного натрію 2-водного масою 0,124 г і навішування натрію хлориду масою 1,74 г переносять у мірну колбу місткістю 100 см3,2 додають 0. Перемішують та доводять об'єм розчину в колбі до мітки. Термін зберігання – 1 місяць у холодильнику.

5.3. Приготування сумішей розчинників

Толуол-оцтова кислота (98:2 % про.).

У мірну колбу на 1000 см3 вносять 20 см3 оцтової кислоти і, перемішуючи, толуолом доводять до мітки. Термін зберігання – 1 місяць у темному прохолодному місці.

Ацетонітрил-вода (60:40 % про.).

У мірну колбу на 1000 см3 вносять 600 см3 ацетонітрилу і, перемішуючи, водою доводять до мітки. Термін зберігання – 1 місяць у темному прохолодному місці.

Ацетонітрил-вода (60:40 % про.; рН = 3 ,0 ).

У мірну колбу на 1000 см3 вносять 600 см3 ацетонітрилу і, перемішуючи, доводять бидистильованою водою до мітки. Внесенням фосфорної кислоти підводять рН суміші до величини, що дорівнює 3,0. Термін зберігання – 1 місяць у темному прохолодному місці.

Метанол-оцтова кислота (98:2 % про.).

У мірну колбу на 1000 см3 вносять 20 см3 оцтової кислоти і, перемішуючи, метанолом доводять до мітки. Термін зберігання – 1 місяць у темному прохолодному місці.

. Відбір та підготовка проб для аналізу

6.1. Відбір проб

Для врахування специфіки відбору проб окремих видів продуктів слід керуватися чинною нормативно-технічною документацією:

«Зерно. Правила приймання та методи відбору проб» ГОСТ 13586.3-83;

«Крупа. Правила приймання та методи відбору проб» ГОСТ 26312.1-84;

«Борошно і висівки. Приймання та методи відбору проб» ГОСТ 27668-88;

«Продукти харчові консервовані. Відбір проб та підготовка їх до випробування» ГОСТ 8756.0-70.

Проби для аналізу, представницькі за концентрацією мікотоксинів для всієї партії, слід відбирати із попередньо гомогенізованого середнього (вихідного) зразка масою 2 кг.

6.2. Підготовка проб для аналізу

Відібрані проби подрібнюють протягом 1 - 2 хв у лабораторному млині. При цьому використовують дві паралельні проби.

6.2.1. Екстракція

Наважку 25 г подрібненої проби поміщають у плоскодонну конічну колбу на 250 см, додають 100 см3 суміші ацетонітрил-вода (60:40 % об.). Екстрагують на апараті для струшування проб протягом 30 хв. Отриману суміш фільтрують через паперовий складчастий фільтр "синя стрічка". Відбирають 10 см3 фільтрату і додають 90 см буферного фосфатного розчину, рН = 7,4.

6.2.2. Очищення екстракту

На імуноафінну колонку наносять 100 мл отриманої суміші зі швидкістю 1 - 2 краплі в секунду, промивають 20 см3 буферного фосфатного розчину, рН = 7,4. Охратоксин А елююють 3 см3 суміші метанол-оцтова кислота (98: 2% об.).

. Виконання вимірів

7.1. Приготування тестового зразка

Елюат упарюють насухо. Сухий залишок розчиняють у 400 мкл рухомої фази (розчин А).

7.2. Умови хроматографування

Умови ВЕРХ: рухома фаза - ацетонітрил-вода (60:40% об.; рН = 3,0); швидкість рухомої фази – 1,5 см3/хв.

Флуориметричний детектор встановлюють на довжину хвилі збуджуючого випромінювання 333 нм, лінії емісії встановлюють емісійний фільтр зі смугою пропускання 466 нм.

Для аналізу проб інжектор хроматографа вводять за допомогою мікрошприца 50 мкл тестового зразка (розчину А). За наявності піку, що збігається за часом утримування з охратоксином А, розраховують масу охратоксину А у поколі за допомогою градуювального графіка.

. Обробка результатів виміру

8.1. Побудова градуйованої залежності

Для побудови градуювального графіка проводять хроматографічний аналіз серії робочих розчинів стандартів. В інжектор за допомогою мікрошприца вводять 50 мкл робочого розчину стандарту з концентрацією 0,005 нг/мкл, що відповідає 0,25 нг охратоксину А. Подібне робиться для інших стандартних розчинів з концентраціями 0,05 та 0,10 нг/мкл, що у свою чергу відповідає 2,5 та 5,0 нг охратоксину А у поколі. У зазначених умовах час утримання знаходиться для охратоксину А в діапазоні від 4 до 5 хв. На підставі отриманих даних будують градуювальний графік (залежність площі хроматографічного піку від охратоксину А маси в колі).

Результат аналізу подають у вигляді (при ймовірності Р = 0,95):

D – межа абсолютної похибки:

d – межа відносної похибки методики (показник точності), % (табл. 1).

* 0,0001 мг/кг - межа виявлення.

. Вимоги до кваліфікації виконавця

До виконання аналізу охратоксину А в зерні та зернопродуктах допускаються особи зі спеціальною вищою освітою або середньою спеціальною освітою, які володіють технікою ВЕРХ-аналізу, пройшли відповідну підготовку та мають досвід роботи в хімічній лабораторії.

. Умови виконання вимірювань

Температура навколишнього повітря від 15 до 25 °С.

Відносна вологість повітря трохи більше 80 % при 25 °З.

Атмосферний тиск 730 – 760 мм рт.ст.

Напруга електроживлення: 210 – 220 В. Частота змінного струму: 45 – 50 Гц.

Концентрація охратоксину А в пробі, мг/кг

Межі відносної похибки (показник точності) (±d), %, Р = 0,95

Стандартне відхилення повторюваності (s r), %

Межа повторюваності ( r), %

Повнота вилучення речовин, %

4. Засоби вимірювань, допоміжні пристрої, посуд, реактиви та матеріали

4.1. Засоби вимірів

4.2. Допоміжне обладнання

Апарат для струшування проб типу АВУ-6С або аналогічний	ТУ 64-1-2451
Ротаційний випарник ІР-1М з пасткою або аналогічний	ТУ 25-11917
Електрошафа сушильна лабораторна з похибкою підтримання температури ±2,5 в інтервалі від 50 до 350 °С	ТУ 16-531.639
Холодильник побутовий
Млин лабораторний електричний ЕМ-3А або аналогічний рН-метр	ТУ 46-22-236-79
Магнітна мішалка типу ММ 5 з стрижнем, що перемішує.	ТУ 25-11.834-80
Колби плоскодонні конічні на 250 см 3 з НШ 29, тип КНКШ 250-29/32	ГОСТ 10394-74
Флакони скляні, що загвинчуються з темного скла (вайл), об'ємом 7 см 3
Колби мірні, місткістю 100, 500, 1000 см 3 тип 2-100-2,2-500-2
Вирви лабораторні
Колби груші на 10 см 3 з НШ 14,5, тип ГрКШ-10-14/23	ГОСТ 10394-72

4.3. Реактиви та матеріали

Натрій фосфорно-кислий однозаміщений, 2-водний, чда
Натрій хлорид, хч
Ацетонітрил, осч, сорт 0
Метанол, осч
Кислота фосфорна, осч	ТУ 2612-014-00203677-97
Кислота оцтова крижана, хч
Толуол, ЧДА
Імуноафінні колонки Ochraprep (R-Biopharm, Великобританія)

. Підготовка до виконання вимірювань

5.1. Приготування стандартних розчинів охратоксину А

Для приготування стандартного розчину зберігання (концентрація охратоксину А - 10 нг/мкл) навішування кристалічного охратоксину А масою 5 мг поміщають у мірну колбу об'ємом 500 см 3 приливають 50 см 3 суміші толуол-оцтова кислота (98:2 % об.), т. перемішують до повного розчинення речовини та доводять тією ж сумішшю розчинників до мітки. Для точної концентрації розчину зберігання вимірюють його оптичну щільність при довжині хвилі 333 нм (Д 333). Концентрацію розчину обчислюють за такою формулою:

Далі 5 см 3 стандартного розчину охратоксину А з концентрацією 10 нг/мкл розбавляють сумішшю толуол-оцтова кислота (98: 2 % об.) до об'єму 100 см 3 отримуючи робочий розчин з концентрацією 0,5 нг/мкл.

Для приготування робочих розчинів охратоксину з концентрацією 0,005; 0,05 та 0,1 нг/мкл відбирають відповідно 50, 500 та 1000 мкл розчину з концентрацією 0,5 нг/мкл, упарюють насухо і розчиняють у 5 см 3 рухомої фази.

Розчин зберігання охратоксину А містять у скляному посуді з притертою пробкою в темному прохолодному місці (при температурі близько 0 ° С) до одного року і використовують для приготування робочих стандартних розчинів. Робочі стандартні розчини зберігають у вайлах із темного скла у темному прохолодному місці (при температурі близько 0 °С) протягом 1 місяця.

Перед використанням робочих стандартних розчинів їх довести до кімнатної температури і тільки після цього слід відкривати пробки.

5.2. Приготування буферного фосфатного розчину, рН = 7,4

Наважку натрію фосфорнокислого двузамещенного 12-водного масою 1,15 г, навішування однозаміщеного натрію 2-водного масою 0,124 г і навішування натрію хлориду масою 1,74 г переносять у мірну колбу місткістю 100 см 3 , додають Перемішують та доводять об'єм розчину в колбі до мітки. Термін зберігання – 1 місяць у холодильнику.

5.3. Приготування сумішей розчинників

Толуол-оцтова кислота (98:2 % про.).

У мірну колбу на 1000 см 3 вносять 20 см 3 оцтової кислоти та, перемішуючи, доводять толуолом до мітки. Термін зберігання – 1 місяць у темному прохолодному місці.

Ацетонітрил-вода (60:40 % про.).

У мірну колбу на 1000 см 3 вносять 600 см 3 ацетонітрилу і, перемішуючи, водою доводять до мітки. Термін зберігання – 1 місяць у темному прохолодному місці.

Ацетонітрил-вода (60:40 % про.; рН = 3 ,0 ).

У мірну колбу на 1000 см 3 вносять 600 см 3 ацетонітрилу і, перемішуючи, доводять водою бідистильованої до мітки. Внесенням фосфорної кислоти підводять рН суміші до величини, що дорівнює 3,0. Термін зберігання – 1 місяць у темному прохолодному місці.

Метанол-оцтова кислота (98:2 % про.).

У мірну колбу на 1000 см 3 вносять 20 см 3 оцтової кислоти і, перемішуючи, метанолом доводять до мітки. Термін зберігання – 1 місяць у темному прохолодному місці.

. Відбір та підготовка проб для аналізу

6.1. Відбір проб

Для врахування специфіки відбору проб окремих видів продуктів слід керуватися чинною нормативно-технічною документацією:

«Зерно. Правила приймання та методи відбору проб» ГОСТ 13586.3-83;

«Крупа. Правила приймання та методи відбору проб» ГОСТ 26312.1-84;

«Борошно і висівки. Приймання та методи відбору проб» ГОСТ 27668-88;

«Продукти харчові консервовані. Відбір проб та підготовка їх до випробування» ГОСТ 8756.0-70.

Проби для аналізу, представницькі за концентрацією мікотоксинів для всієї партії, слід відбирати із попередньо гомогенізованого середнього (вихідного) зразка масою 2 кг.

6.2. Підготовка проб для аналізу

Відібрані проби подрібнюють протягом 1 - 2 хв у лабораторному млині. При цьому використовують дві паралельні проби.

6.2.1. Екстракція

Наважку 25 г подрібненої проби поміщають у плоскодонну конічну колбу на 250 см, додають 100 см 3 суміші ацетонітрил-вода (60:40 % об.). Екстрагують на апараті для струшування проб протягом 30 хв. Отриману суміш фільтрують через паперовий складчастий фільтр "синя стрічка". Відбирають 10 см 3 фільтрату і додають 90 см буферного фосфатного розчину, рН = 7,4.

6.2.2. Очищення екстракту

На імуноафінну колонку наносять 100 мл отриманої суміші зі швидкістю 1 - 2 краплі в секунду, промивають 20 см 3 буферного фосфатного розчину, рН = 7,4. Охратоксин А елююють 3 см 3 суміші метанол-оцтова кислота (98: 2% об.).

. Виконання вимірів

7.1. Приготування тестового зразка

Елюат упарюють насухо. Сухий залишок розчиняють у 400 мкл рухомої фази (розчин А).

7.2. Умови хроматографування

Умови ВЕРХ: рухома фаза - ацетонітрил-вода (60:40% об.; рН = 3,0); швидкість рухомої фази - 1,5 см 3 /хв.

Флуориметричний детектор встановлюють на довжину хвилі збуджуючого випромінювання 333 нм, лінії емісії встановлюють емісійний фільтр зі смугою пропускання 466 нм.

Для аналізу проб інжектор хроматографа вводять за допомогою мікрошприца 50 мкл тестового зразка (розчину А). За наявності піку, що збігається за часом утримування з охратоксином А, розраховують масу охратоксину А у поколі за допомогою градуювального графіка.

. Обробка результатів виміру

8.1. Побудова градуйованої залежності

Для побудови градуювального графіка проводять хроматографічний аналіз серії робочих розчинів стандартів. В інжектор за допомогою мікрошприца вводять 50 мкл робочого розчину стандарту з концентрацією 0,005 нг/мкл, що відповідає 0,25 нг охратоксину А. Подібне робиться для інших стандартних розчинів з концентраціями 0,05 та 0,10 нг/мкл, що у свою чергу відповідає 2,5 та 5,0 нг охратоксину А у поколі. У зазначених умовах час утримання знаходиться для охратоксину А в діапазоні від 4 до 5 хв. На підставі отриманих даних будують градуювальний графік (залежність площі хроматографічного піку від охратоксину А маси в колі).

8.2. Оформлення результатів

Розрахунок концентрації охратоксину А в пробі проводиться за формулою:

З (охр. А)- Концентрація охратоксину А в пробі, мг/кг;

М- Маса навішування для аналізу, г (25,0);

т- маса охратоксину А, що відповідає введеному в хроматограф об'єму розчину А, нг;

V 1 - Об'єм розчину для екстракції, см 3 (100);

D - межа абсолютної похибки:

d - межа відносної похибки методики (показник точності), % (табл. 1).

Якщо вміст охратоксину А в пробі менш нижньої межі діапазону визначених концентрацій, результат аналізу подають у вигляді:

* 0,0001 мг/кг - межа виявлення.

8.3. Перевірка прийнятності результатів паралельних визначень

Допустима розбіжність між паралельними вимірами (R) визначають на підставі межі повторюваності (r) (табл. 1):

R = 0,01 (r, %) × , мг/кг

Якщо розбіжність між паралельними визначеннями вбирається у допустимого:

то середнє арифметичне приймають за результат аналізу.

При перевищенні нормативуRслід повторити виміри, використовуючи резервні проби.

. Контроль якості результатів вимірів

Періодичність контролю похибки вимірів залежить кількості робочих вимірів за контрольований період і визначається планами контролю.

Зразками контролю є робочі проби продовольчої сировини та харчових продуктів. Відбирають пробу і поділяють на 2 рівні частини. Одну з них залишають без змін, а до іншої додають таку кількість розчину стандарту охратоксину А, щоб його масова частка в пробі порівняно з вихідним значенням збільшилася на 50-100%. Добавка повинна вводитись у пробу перед початком пробопідготовки.

Обидві проби аналізують у точній відповідності до пропису методики та отримують результати аналізу вихідної проби ( З (отр.А)) та проби з добавкою ( З ¢ (Отр.А)). Визначення проводять в однакових умовах, а саме: аналіз проводить один аналітик з використанням одного набору мірного посуду, реактивів, розчинів і т.д.

Алгоритм проведення оперативного контролю похибки з використанням методу добавок полягає у порівнянні результату контрольного визначення, що дорівнює різниці між результатом контрольного вимірювання проби з добавкою ( З ¢ (Охр.А)), проби без добавки ( З (охр.А)) та величиною добавки ( З доб(охр.А)) з нормативом оперативного контролю (K). Рішення про задовільну похибку приймається при виконанні наступної умови (при Р і

Температура навколишнього повітря від 15 до 25 °С.

Відносна вологість повітря трохи більше 80 % при 25 °З.

Атмосферний тиск 730 – 760 мм рт.ст.

Напруга електроживлення: 210 – 220 В. Частота змінного струму: 45 – 50 Гц.