dom » Edukacja

Metoda przetwarzania i analizy obrazów obiektów przypominających komety uzyskanych metodą „DNA-kometa”. Współczesne problemy nauki i edukacji Przygotowanie komórek do przeszczepienia

Metoda polega na wprowadzeniu do komputera obrazu zawierającego obiekty przypominające komety – „komety”, czyli zbiór połączonych i oddzielnych punktów fluorescencyjnych o różnej jasności, do komputera z próbki biologicznej zainstalowanej na mikroskopie fluorescencyjnym z kamerą wideo. Następnie wyszukują na obrazie owe „komety”, zaznaczają ich zarys wraz z określeniem granicy „głowy” i „ogona” oraz przeprowadzają morfometrię mikroskopową. Przed wyszukaniem „komet” na obrazie optymalizowane są poziomy jasności obrazu i przeprowadzane jest filtrowanie dolnoprzepustowe w celu połączenia poszczególnych punktów „komet” w rozmyte obszary. Następnie powstały obraz jest segmentowany na podstawie progu jasności, definiowanego jako odsunięcie od tła, kontury „komet” wyszukuje się wypełniając ograniczony obszar „ziarnem”, gdzie ziarnem jest dowolny punkt należący do „komety”, wyznacza się środek głowy każdej „komety”, wyznaczając środek ciężkości punktów o intensywności luminescencji bliskiej maksymalnej. Wyznaczanie wirtualnej granicy „głowy” i „ogona” odbywa się poprzez odbicie lustrzane rozkładu natężeń luminescencji punktów w przedniej części głowy komety, następnie przeprowadza się mikroskopową morfometrię „komet” poprzez pomiar: długość „komety”, „ogona” i średnica „głowy”. Następnie obliczany jest procent DNA w całej „komecie”, w „ogonie” oraz miary uszkodzeń DNA. Wymienione operacje wykonywane są automatycznie, jednocześnie na wszystkich „kometach” w serii zdjęć. Rezultatem technicznym jest zwiększenie dokładności i szybkości przetwarzania i analizy obrazów „komet”.

Metoda przetwarzania i analizy obrazów obiektów kometopodobnych uzyskanych metodą „komety DNA” (test kometowy lub elektroforeza żelowa jednokomórkowa – SCGE) w preparatach biologicznych należy do dziedziny przetwarzania i analizy obrazów obiektów – „komet”, i przeznaczony jest do komputeryzacji (automatyzacji) procesów badań morfometrycznych z zakresu biomedycyny, prowadzonych w celu określenia stopnia uszkodzenia cząsteczek DNA przez różne czynniki środowiskowe, badania naprawy cząsteczek DNA na poziomie pojedynczych komórek, oceny integralności genomu, określenia indywidualnej radiowrażliwości pacjentów chorych na nowotwory poddawanych radioterapii, bioindykacji przybrzeżnych wód morskich, czyli monitorowania szerokiego zakresu uszkodzeń DNA powodowanych przez mutagenne czynniki środowiskowe.

Obrazy „komet” to zbiór stopionych i oddzielnych punktów fluorescencyjnych o różnej jasności, otrzymany w drodze elektroforezy żelowej zlizowanych pojedynczych komórek (metoda „komety DNA”), dlatego nie ma możliwości ich obróbki i analizy w sposób przeznaczony dla obrazów zwykłych (stałych) obiektów.

Obecnie obrazy „komet DNA” analizuje się albo poprzez obserwację wizualną pod mikroskopem fluorescencyjnym i różnicowanie ich ze względu na stopień uszkodzenia DNA, albo przy użyciu komputerowych narzędzi przetwarzania obrazu.

Za pomocą analizy wizualnej (Struwe M, Greulich K, Suter W, Plappert-Helbig U. The photo comet assay - A fast screening assay for the determination fotogenotoksyczność in vitro. // Mutation Research / Genetic Toxicology and Environmental Mutageneza. 2007, 632 ( 1-2), s. 44-57) „Komety DNA” dzieli się na pięć typów warunkowych z odpowiadającą im wartością liczbową od 0 do 4. Stopień uszkodzenia DNA wyraża się jako wskaźnik „komety DNA” (AND DNA), określony wzorem

Oraz DNA =(0n 0 +1n 1 +2n 2 +3n 3 +4n 4)/ ,

gdzie n 0 -n 4 to liczba „komet DNA” każdego typu, jest sumą zliczonych „komet DNA”.

Ta metoda przetwarzania i analizy jest bardzo pracochłonna, subiektywna, posiada jedynie pięć stopni gradacji różnicowania „komet DNA” i dlatego charakteryzuje się niską dokładnością, a co za tym idzie niską wiarygodnością wyników.

Najbliżej proponowanego rozwiązanie techniczne to metoda komputerowej analizy obrazów „komet DNA” zaimplementowana w programie SCGE-Pro (patrz oprogramowanie do analizy komputerowego obrazu Chaubery R.C. dla testu kometowego. Methods In Molecular Biology 2005; 291:97-106), przyjęta jako prototyp . Ta metoda analizy „komet” jest mniej pracochłonna i jest szczególnie konieczna do obiektywnej oceny ich parametrów (na przykład długości „komety”, długości „ogona”, średnicy „głowy” , procent DNA w „głowie” lub „ogonie” itp.), które służą jako wskaźniki charakteryzujące poziom uszkodzenia DNA w badanych komórkach. Metoda pozwala na odnalezienie na obrazie „komet” i obliczenie ich parametrów zarówno ręcznie, jak i automatycznie.

Wadą tej znanej metody jest sposób wyznaczania granic „komety” za pomocą prostokątnego obszaru, co zmniejsza dokładność obliczania parametrów niezbędnych do oceny uszkodzeń DNA (zwłaszcza jeśli uszkodzenie jest słabo wyrażone), ponieważ w tym przypadku zakłócenia znajdujące się w pobliżu można również przypisać komecie. Dodatkowo przy tej metodzie analizy granicę „głowy” i „ogona” definiuje się jako linię prostą, prostopadłą do osi „komety” i dzielącą kometę na „głowę” i „ogon”, która znacznie zmniejsza dokładność obliczania długości „ogona komety” oraz procentowej zawartości DNA w „głowie” i „ogonie”.

Efektem technicznym wynalazku jest zwiększenie dokładności i szybkości przetwarzania i analizy obrazów „komet” uzyskanych metodą „komet DNA”, obejmujące filtrowanie, segmentację „komet”, uwydatnianie ich konturu z określeniem granic „głowy” i „ogona”, co pozwala na zwiększenie wiarygodności wyników morfometrii mikroskopowej, niezbędnej do komputeryzacji procesów badań biometrycznych prowadzonych przy monitorowaniu szerokiego zakresu uszkodzeń DNA powodowanych przez różne mutagenne czynniki środowiskowe.

Wynik techniczny osiąga się przez to, że metoda przetwarzania i analizowania obrazów obiektów przypominających komety uzyskanych metodą „komet DNA”, polegająca na tym, że wprowadzany jest obraz obiektów podobnych do komet – „komet” do komputera z próbki biologicznej zainstalowanej na mikroskopie fluorescencyjnym z kamerą wideo, przedstawiającej zbiór połączonych i oddzielnych punktów fluorescencyjnych o różnej jasności, wyszukaj te „komety” na obrazie, zaznacz ich kontur z określeniem granicy „głowę” i „ogon”, wykonaj morfometrię mikroskopową, a przed wyszukaniem „komet” na obrazie wykonaj optymalizację poziomu jasności obrazu i filtrowanie niskich częstotliwości w celu połączenia poszczególnych punktów „komet” w obszary rozmyte , następnie posegmentuj powstały obraz w oparciu o próg jasności, zdefiniowany jako odsunięcie od tła, znajdując kontury „komet” poprzez wypełnienie ograniczonego obszaru „nasionem”, znajdując środkową „głowę” każdej „komety” , wyznaczając środek ciężkości punktów o natężeniu luminescencji bliskim maksymalnym, wyznaczając wirtualną granicę „głowy” i „ogona”, odwzorowując rozkład natężeń luminescencji punktów znajdujących się na przedniej części „komety głowy”, następnie przeprowadzając mikroskopową morfometrię „komet”, mierząc: długość „komety”, „ogona”, średnicę „głowy” i obliczając procent DNA w całej „komecie”, „w ogonie” ", pomiary uszkodzeń DNA i wiele innych parametrów charakteryzujących stopień uszkodzenia DNA w zależności od rozwiązywanego problemu, a wymienione operacje wykonywane są automatycznie, jednocześnie na wszystkich „kometach” znajdujących się na obrazie lub serii obrazów.

Metodę przeprowadza się poprzez wykonanie sekwencji następujących procedur:

1. Wprowadź do komputera próbkę biologiczną zainstalowaną pod mikroskopem fluorescencyjnym z kamerą wideo, obrazy przedstawiające obiekty przypominające komety - „komety”, które są zbiorem stopionych i oddzielnych punktów fluorescencyjnych o różnej jasności.

2. Zoptymalizuj poziom jasności obrazu. Zerowa jasność to tło, maksymalna jasność to środek głowy „komety”.

3. Dolnoprzepustowy filtr gaussowski (rozmycie) o dużym promieniu równym 1/10 promienia przeciętnej „komety” przeprowadza się w celu połączenia poszczególnych punktów „komet” w obszary rozmyte. Aby zapobiec łączeniu się komet znajdujących się blisko siebie, zastosowano interaktywną regulację promienia rozmycia.

4. Segmentacja powstałych obszarów rozmytych odbywa się na podstawie progu jasności. Próg jest ustalany automatycznie jako odsunięcie od tła (na obrazie nie ma obcych wtrąceń ani obiektów innych niż „komety”), ale próg można regulować interaktywnie.

5. Znalezienie konturów „komet” poprzez wypełnienie ograniczonego obszaru „nasionem”, gdzie przez ziarno rozumie się dowolny punkt należący do „komety”.

Znalezienie środka „głowy komety”. Do określenia można zastosować dwie metody: poprzez maksymalny rozkład intensywności świecenia punktów „komety” wzdłuż osi poziomej lub przez środek ciężkości punktów o intensywności świecenia przekraczającej 80% wartości maksymalnej.

Wyznaczenie wirtualnej granicy „głowy” i „ogona” poprzez odzwierciedlenie rozkładu natężeń luminescencji punktów w przedniej części „głowy komety” (część przednia to część do przedniej granicy „komety głowa").

Wykonywanie morfometrii mikroskopowej „komet” poprzez pomiar: długości „komety”, długości „ogona”, średnicy „głowy” oraz obliczenie procentowej zawartości DNA w całej „komecie”, „w ogonie” ”, miary uszkodzeń DNA i wiele innych parametrów charakteryzujących stopień uszkodzenia DNA w zależności od rozwiązywanego problemu.

9. Wartości uzyskanych parametrów każdej komety wyprowadzane są do tabeli MS EXCEL w celu realizacji zadania użytkownika, np. do dalszej analizy statystycznej lub klasyfikacji „komet” ze względu na stopień uszkodzenia struktury DNA.

Zatem w proponowanej metodzie każdy obszar komety jest zdefiniowany przez ich złożony kontur, co zwiększa dokładność obliczania parametrów, w przeciwieństwie do znanej metody, gdzie granice „komet” wyznaczane są za pomocą prostokąta obszar, co zmniejsza dokładność obliczania parametrów niezbędnych do oceny uszkodzeń (zwłaszcza jeśli uszkodzenie jest słabo wyrażone) „komety DNA”, ponieważ w tym przypadku zakłócenia znajdujące się w pobliżu można również sklasyfikować jako „kometę”. Ponadto w znanej metodzie granicę „głowy” i „ogona” definiuje się jako linię prostą, prostopadłą do osi komety i dzielącą kometę na „głowę” i „ogon”. Zaproponowana metoda wykorzystuje wirtualną granicę wyznaczoną poprzez obliczenie środka „głowy komety” i odzwierciedlenie rozkładu intensywności świecenia punktów w przedniej części „głowy komety”. Zwiększa to znacząco dokładność obliczania długości ogona komety oraz procentowego udziału DNA w „głowie i ogonie”.

Należy zaznaczyć, że wszystkie powyższe operacje wykonywane są automatycznie jednocześnie na wszystkich „kometach” znajdujących się na obrazie lub serii obrazów.

PRAWO

Metoda przetwarzania i analizy obrazów obiektów kometopodobnych uzyskanych metodą „DNA-komet”, polegająca na wprowadzeniu na obraz obiektów kometopodobnych – „komet”, które stanowią zbiór stopionych i oddzielnych punktów fluorescencyjnych o różnych jasność, wyszukać te „komety” na obrazie, podkreślić ich kontur z określeniem granicy „głowy” i „ogona”, przeprowadzić morfometrię mikroskopową, charakteryzującą się tym, że przed poszukiwaniem „komet” na obrazie, optymalizację poziomy jasności obrazu i filtrowanie niskich częstotliwości w celu połączenia poszczególnych punktów „komet” w obszary rozmyte, następnie segmentacja powstałego obrazu odbywa się w oparciu o próg jasności, zdefiniowany jako odsunięcie od tła, znalezienie konturów „komet” ” poprzez wypełnienie ograniczonego obszaru „ziarnem”, gdzie ziarnem jest dowolny punkt należący do „komety”, znalezienie środka głowy każdej „komety” poprzez określenie środka ciężkości punktów o natężeniu luminescencji blisko maksimum, wyznaczenie wirtualnej granicy „głowy” i „ogona” poprzez odzwierciedlenie rozkładu natężeń luminescencji punktów w przedniej części głowy komety, a następnie wykonanie mikroskopowej morfometrii „komet” poprzez pomiar długości „komety”, „ogona”, średnicy „głowy” oraz obliczenie procentowego udziału DNA w całej „komecie”, w „ogonie” oraz miary uszkodzenia DNA, przy czym powyższe operacje wykonywane są automatycznie, jednocześnie na wszystkich „kometach” na serii zdjęć.

1

Badania wskaźników fragmentacji DNA przeprowadzono metodą kometową DNA w modyfikacji zasadowej w warunkach różne poziomy narażenie na czynniki radiacyjne w warunkach domowych. Uwzględniono aktywność objętościową (VA) radonu, dawkę równoważną otoczenia (AER) promieniowania gamma i gęstość strumienia promieniowania beta. Średnia wartość radonu OA w powietrzu wewnętrznym wynosiła 89,4 Bq/m3, wartość tła gamma MAED wynosiła 0,12 μSv/h, a gęstość strumienia promieniowania beta wynosiła 0,6 s-1. Średni poziom fragmentacji DNA wyniósł 3,48%. Poziom fragmentacji DNA dla 3 wskaźników (proporcja DNA w ogonie komety, długość ogona komety, moment ogona komety) był podwyższony u mężczyzn, ale tendencja ta nie osiągnęła istotności statystycznej. Wyniki DNA komet nie różniły się znacząco w zależności od zmian poziomu radonu. Odkryto dodatnią korelację wskaźników komet DNA ze wzrostem mocy promieniowania gamma. Jednocześnie DER promieniowania gamma we wszystkich badanych pomieszczeniach mieścił się w dopuszczalnych granicach.

promieniowanie jonizujące

komety DNA

zasadowa modyfikacja DNA komet

skutki niskich dawek promieniowania

1. Robertson A., Allen J., Laney R., Curnow A. Komórkowe i molekularne rakotwórcze skutki narażenia na radon: recenzja // Int. J. Mol. Sci., 2013, tom. 14, nie. 7, s. 14024-14063.

2. Druzhinin V.G., Sinitsky M.Y., Larionov A.V. i in. Ocena poziomu aberracji chromosomowych w limfocytach krwi obwodowej u dzieci długoterminowo przebywających w warunkach dużego narażenia na radon i produkty jego rozpadu // Mutageneza, 2015, tom. 30, s. 677–683.

3. Singh N.P., McCoy M.T., Tice R.R., Schneider E.L. Prosta technika ilościowego oznaczania niskich poziomów uszkodzeń DNA w poszczególnych komórkach // Exp. Cell Res., 1988, tom. 175, s. 184–191.

4. Azqueta A., Gutzkow K.B., Brunborg G., Collins A.R. W kierunku bardziej niezawodnego testu kometowego: optymalizacja stężenia agarozy, czasu odwijania i warunków elektroforezy // Mutat. Res., 2011, tom. 724, nie. 1–2, s. 1–2. 41-45.

5. Konca K., Lankoff A., Banasik A. i in. Wieloplatformowy program do analizy obrazu komputerowego należący do domeny publicznej do testu kometowego // Mutation Research, 2003, tom. 534, s. 15-20.

6. Glantz S.A. Elementarz Biostatystyki / S.A. Glantz. – McGraw-Hill Medical, wydanie 7, 2011. – 320 s.

7. Georgakilas A.G., O’Neill P., Stewart R.D. Indukcja i naprawa skupionych uszkodzeń DNA: co wiemy do tej pory? //Promieniowanie. Res., 2013, tom. 180, s. 100–109.

8. Kaur S., Sangeeta, Galhna K.K., Gautam N. Ocena uszkodzeń DNA wywołanych promieniowaniem w limfocytach ludzkiej krwi obwodowej za pomocą testu COMET // Int. J. Life Sci. Naukowe. Res., 2017, tom. 3, nie. 4, s. 1208-1214.

9. Miklos M., Gajski G., Garaj-Vrhovac V. Zastosowanie standardowego i zmodyfikowanego testu kometowego w ocenie uszkodzeń DNA w limfocytach ludzkich po ekspozycji na promieniowanie jonizujące // Radiology and Oncology, 2009, tom. 43, nie. 2, s. 97-107.

10. Batar B., Guven M., Baris S. i in. Polimorfizmy genu naprawy DNA XPD i XRCC1 a ryzyko ostrej białaczki limfoblastycznej u dzieci // Leuk. Res., 2009, tom. 33. s. 759–763.

11. Jiang J., Zhang X., Yang H., Wang W. Polimorfizmy genów naprawy DNA: ADPRT, XRCC1 i XPD a ryzyko raka w epidemiologii genetycznej // Meth. Mol. Biol., 2009, tom. 471. s. 305–333.

12. Larionov A.V., Sinitsky M.Yu., Druzhinin V.G. i in. Polimorfizmy genów naprawy przez wycinanie DNA i naprawy pęknięć dwuniciowych a poziom aberracji chromosomowych u dzieci z długotrwałym narażeniem na radon // Int. J. Radiat. Biol., 2016, tom. 92, nie. 8, s. 466-474.

13. Wojewodzka M., Kruszewski M., Iwanenko T. i in. Brak niekorzystnego wpływu nałogu palenia na pękanie nici DNA i uszkodzenie zasad, co wykazał alkaliczny test kometowy // Mutat. Res., 1999, tom. 440, s. 19–25.

14. Geric M., Gajski G., Orescanin V., Garaj-Vrhovac V. Zmienność sezonowa jako czynniki predykcyjne parametrów testu kometowego: badanie retrospektywne // Mutagenesis, 2017, doi:10.1093/mutage/gex023.

Skutki radonu zostały dobrze zbadane w wysokim zakresie stężeń. Ustalone normy higieniczne przewidują poziom równoważnej równowagowej aktywności objętościowej (ERVA) wynoszący 200 Bq/m3 jako granicę dopuszczalnej aktywności objętościowej radonu w powietrzu pomieszczeń mieszkalnych. Jednocześnie w wielu krajach dopuszczalny poziom został podwyższony do 400 Bq/m3, co wynika przede wszystkim z cech geologicznych terytorium. Z drugiej strony istnieje pogląd o konieczności redukcji dopuszczalny poziom do 2 pCu/l, co odpowiada 74 Bq/m3. W ramach współczesnego paradygmatu WHO i zasady liniowego, bezprogowego narastania skutków promieniowania, nawet niewielka ekspozycja na promieniowanie prowadzi do wzrostu ryzyka wystąpienia skutków stochastycznych (przede wszystkim nowotworów).

Oczywiste jest, że małe skutki promieniowania wpływają duże grupy ludzi może prowadzić do istotnego społecznie wzrostu zachorowalności na nowotwory. W rezultacie niezwykle istotne wydaje się gromadzenie informacji o skutkach różnego rodzaju promieniowania jonizującego w małych dawkach, na które w mniejszym lub większym stopniu narażona jest cała populacja planety. Wzrost zawartości energii radonu powyżej 200 Bq/m3 jest uważany za niepożądany przez większość przyjętych standardów w zakresie higieny radiacyjnej. Jednocześnie jedynie 5-10% lokali mieszkalnych można zaliczyć do lokali o tym poziomie ekspozycji. Aktywność objętościową (VA) radonu wynoszącą 2 pCiu/l (74 Bq/m3) i wyższą można zaobserwować w 20-50% lokali mieszkalnych, w zależności od rodzaju budynku i położenia geograficznego. Oczywistym jest, że nawet niewielkie narażenie na radon, biorąc pod uwagę globalną skalę problemu, może prowadzić do istotnego wzrostu zachorowalności. Wydaje się obecne badania Wpływ niskodawkowych ładunków gęsto jonizującego promieniowania na organizm człowieka.

Radon jest obecnie uznawany za jeden z najniebezpieczniejszych czynników rakotwórczych wpływających na człowieka. W naturze współczynnik radonu promieniowania nie odgrywa znaczącej roli, ponieważ radon jest rozproszony w dużej objętości powietrza i dość szybko zanika (okres półtrwania Rn222 = 3,82 dnia). Jednocześnie budynki mieszkalne i techniczne są swoistymi pułapkami, które gromadzą radon (nawet 10-krotnie w porównaniu do otwartego powietrza). Ogniska emisji radonu są często lokalizowane sporadycznie, a radon jest uważany za główną przyczynę zwiększonej częstotliwości aberracji chromosomowych w podobnie narażonych grupach.

Jedną ze skutecznych metod biomonitoringu jest bezpośrednia ocena stopnia uszkodzenia DNA w komórkach krwi metodą „komety DNA” (elektroforeza żelowa poszczególnych komórek). Ta metoda polega na lizie komórek umieszczonych w żelu agarozowym, podczas gdy DNA migruje w polu elektrycznym. Komórki o zwiększonej częstotliwości podwójnych pęknięć charakteryzują się zwiększoną migracją DNA w kierunku anody. W 1988 roku w pracy Singha i współpracowników zaproponowano zasadową modyfikację metody, obejmującą etap lizy przy pH>13. Wersja ta znacznie zwiększa czułość metody, pozwalając na wykrycie pojedynczych pęknięć, miejsc nietrwałych w środowisku zasadowym, wiązań krzyżowych DNA-DNA i DNA-białko, a także miejsc niepełnej naprawy. Ponieważ w przypadku większości substancji genotoksycznych dominują skutki pojedynczych pęknięć DNA, zasadowa modyfikacja metody umożliwiła znaczne zwiększenie zawartości informacyjnej i czułości testu. Jedną z głównych zalet jest możliwość identyfikacji skutków genotoksycznych w warunkach jednoczesnego działania czynników cytotoksycznych, które prowadzą do powstania nieprawidłowości chromosomalnych, ale nie mają działania genotoksycznego. W warunkach pH>12 DNA ulega denaturacji, a nici rozplatają się w wyniku zniszczenia wiązań wodorowych pomiędzy 2 helisami. Gdy pH osiągnie 12,6, miejsca nietrwałe w środowisku zasadowym, takie jak miejsca apurynowe/apirymidynowe, ulegają przekształceniu w pojedyncze pęknięcia DNA. Przy pH>13 osiąga się maksymalny stopień przemiany miejsc nietrwałych w środowisku alkalicznym.

Materiały i metody

Przykładowe cechy

Każda osoba badana wypełniała ankietę personalną, która zawierała informacje dotyczące wieku, stanu zdrowia, używania tytoniu i alkoholu, ryzyka zawodowego, wykonywanych badań RTG, podróży lotniczych, szczepień i wizyt. leki w ciągu 3 miesięcy poprzedzających egzamin. Do badania wybrano 39 osób, które nie były narażone na działanie czynników potencjalnie genotoksycznych. Wszyscy badani nie mieli więcej niż 40 lat. W sumie przebadano 18 mężczyzn (tj. średni wiek 29 lat) i 21 kobiet (średnia wieku 31 lat).

Badanie przeprowadzono zgodnie z wymogami Komisji Etyki Uniwersytetu Państwowego w Kemerowie, protokół badania został zatwierdzony na posiedzeniu Komisji nr 4 w dniu 10 października 2016 r. Każdy uczestnik podpisał formularz świadomej zgody zawierający informacje o celów badania.

Próbki biomateriałów

Próbki krwi żylnej pobierano do probówek próżniowych o pojemności 4 ml zawierających EDTA sodu jako antykoagulant. Pobieranie materiału odbywało się od listopada 2016 r. do kwietnia 2017 r. W ciągu 1-2 godzin próbki przewożono do laboratorium. Wszystkie próbki zostały zakodowane i przetworzone. Metodę kometową DNA rozpoczęto natychmiast po otrzymaniu próbek.

Elektroforeza żelowa poszczególnych komórek (metoda kometowa DNA)

Metodę kometową DNA przeprowadzono w modyfikacji alkalicznej opracowanej przez Singha i in. Pierwszą warstwę żelu stanowił 1% roztwór standardowej agarozy (Applichem, USA). Do pokrycia komórek zastosowano 1% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (agaroza o niskiej temperaturze topnienia, Applichem, USA) w temperaturze 39°C. Do szklanki z agarozą standardową dodano 70 µl zawiesiny komórek krwi w niskotopliwej agarozie i umieszczono na lodzie do całkowitego zestalenia żelu. Po zestaleniu szkiełka umieszczono w buforze do lizy w temperaturze 4°C na 12 godzin. Skład buforu do lizy: 2,5 mol/l NaCl (Vekton, Rosja), 0,1 mol/l Na2EDTA (Vekton, Rosja), 1% Triton X-100 (Amresco, USA), 10% DMSO („Vecton”, Rosja) . Po lizie przeprowadzono elektroforezę poziomą (300 mA, 25 V, 30 min) w buforze alkalicznym (pH>13). Elektroforezę poprzedzono 20 min. traktowanie buforem alkalicznym (300 mM NaOH (Vekton, Rosja), 1 mM Na2EDTA (Vekton, Rosja). Lizę i elektroforezę przeprowadzono w temperaturze 4°C w nieobecności bezpośredniego światła słonecznego. Po elektroforezie szkła zobojętniono trzykrotnie w sól fizjologiczna buforowana fosforanem PBS pH 7,5 (Amresco, USA). Następnie szkiełka traktowano 70% etanolem przez 5 minut. Preparaty suszono i barwiono 50 µl pojedynczej dawki SYBR GREEN (Biotech-Industry, Rosja).

Analiza komety

Parametry fragmentacji oceniano za pomocą mikrofotografii preparatów barwionych SYBR GREEN przy użyciu mikroskopu Zeiss Axio Imager 2. W sumie sfotografowano 100 losowo wybranych komet z każdej badanej próbki przy powiększeniu x400. Dalsza obróbka zdjęć została przeprowadzona przy wykorzystaniu pakietu oprogramowania CASP. Obliczono parametry długości ogona komety, momentu ogona oraz frakcji DNA w ogonie komety.

metody statystyczne

Do statystycznej analizy danych wykorzystano pakiet Statistica 10.0. Dla wskaźników ilościowych obliczono średnie i 95% granice przedziału ufności (CI 95). Porównania grupowe przeprowadzono za pomocą testu U Manna-Whitneya. Poziom istotności przyjęto na poziomie 5%. Korelacje pomiędzy wynikami dla danych nieparametrycznych obliczono przy użyciu współczynnika korelacji Pearsona dla rang. Jednocześnie dla prób liczących powyżej 50 osób obliczono także wartość testu Studenta w oparciu o wartość współczynnika korelacji Pearsona.

wyniki

Udział DNA w ogonie komety nie przekraczał 15%. Średnia aktywność objętościowa (VA) radonu w powietrzu w pomieszczeniach zamkniętych wyniosła 89,4 Bq/m3, tło gamma DER wyniosło 0,12 μSv/h, a gęstość strumienia promieniowania beta wyniosła 0,6 s-1. Poziom fragmentacji DNA według 3 wskaźników był podwyższony u mężczyzn, jednak tendencja ta nie osiągnęła istotności statystycznej (tab. 1).

Tabela 1

Wskaźniki fragmentacji DNA u badanych mężczyzn i kobiet

Za graniczny poziom radonu OA w powietrzu przyjęto poziom 74 Bq/m3, co odpowiada 2 pCiu/l powietrza. Średni RA radonu wyniósł 47 Bq/m3 w pierwszej grupie i 143 Bq/m3 w drugiej grupie. Największą zawartość informacyjną ustalono dla wskaźnika momentu ogonowego komet. Moment ogonowy był większy w grupie z wyższym poziomem radonu, ale tendencja ta nie osiągnęła istotności statystycznej (tab. 2). Tendencja ta jest charakterystyczna jedynie dla badanych mężczyzn.

Tabela 2

Wskaźniki fragmentacji DNA w grupach zróżnicowanych ze względu na płeć i OA radonową

Radon OA w powietrzu w pomieszczeniu, Bq/m3

% DNA w ogonie komety

Długość ogona, µm

Moment ogona komety

3,65

13,73

0,94

3,97

14,52

1,43

3,30

13,21

0,88

3,00

11,95

0,72

3,43

13,42

0,90

3,51

13,30

1,09

Zbadano także możliwą zależność wskaźników DNA od wielkości promieniowania gamma DER w pomieszczeniach mieszkalnych. W celu weryfikacji obliczono współczynnik korelacji pomiędzy wskaźnikami uszkodzeń DNA a promieniowaniem gamma DER. Stwierdzono dodatnią korelację pomiędzy wskaźnikami komet DNA a wzrostem mocy promieniowania gamma (ryc.). Jednocześnie DER promieniowania gamma we wszystkich badanych pomieszczeniach mieścił się w dopuszczalnych granicach.

Zależność wskaźników fragmentacji DNA od promieniowania gamma DER w pomieszczeniach mieszkalnych (r – współczynnik korelacji Spearmana, p – prawdopodobieństwo hipotezy „zerowej”)

Dyskusja

Narażenie na promieniowanie

Promieniowanie jonizujące może indukować powstawanie skupisk uszkodzeń DNA, które występują w postaci pęknięć dwuniciowych i innych uszkodzeń zlokalizowanych zwarto. Rzadkie i gęste promieniowanie jonizujące powodują w przybliżeniu taką samą liczbę pojedynczych uszkodzeń DNA na jednostkę pochłoniętej dawki, jednak w przypadku gęstego promieniowania jonizującego (cząstki alfa) zmiany te są rozmieszczone w mniejszej liczbie miejsc DNA, co oznacza wzrost liczby zmian w Klaster; na przykład średnia liczba uszkodzeń w klastrze ma tendencję do wzrostu wraz z liniowym transferem energii. Promieniowanie gamma rejestrowane w miejscach zamieszkania wszystkich badanych nie przekracza regulowanych wartości tła. Zmiany tła gamma były najprawdopodobniej spowodowane cechami budynków i materiałów budowlanych.

Analiza komety

Metoda DNA Comet to prosty i szybki test, który skutecznie mierzy poziom uszkodzeń DNA i naprawy uszkodzeń po ekspozycji. W badaniu tym nie stwierdzono istotnej heterogeniczności w zakresie poziomu uszkodzeń DNA w badanej populacji. W wielu pracach poświęconych dozymetrii biologicznej zwrócono uwagę na trudności w identyfikacji wpływu niskich dawek promieniowania. Jednocześnie większość badań dotyczyła grup osób napromieniowanych zewnętrznym sztucznym źródłem, na przykład personelu zakładów radiologicznych i rentgenowskich.

Pomiary szybkości fragmentacji DNA mogą odzwierciedlać zarówno poziom uszkodzeń DNA danej osoby, jak i zdolność do naprawy uszkodzeń spowodowanych promieniowaniem. Wcześniej w szeregu badań ustalono zdolność genów naprawczych do modulowania częstotliwości zaburzeń materiału dziedzicznego. Zaobserwowany wzór uszkodzeń DNA jest wynikiem równowagi pomiędzy uszkodzeniem a naprawą DNA, a niski poziom uszkodzeń lub brak silnych korelacji może wynikać zarówno z małej liczby uszkodzeń, jak i wysokiej indywidualnej efektywności naprawy.

Według niektórych szacunków największy udział we wzroście wartości DNA komet dla czynników pozaprodukcyjnych ma pora roku (podwyższenie parametrów w okresie letnim) oraz narażenie medyczne. W naszej pracy czynniki te nie mogą mieć istotnego wpływu, gdyż pobranie materiału biologicznego odbywało się w zimowym okresie roku, a z próby wykluczono wszystkie osoby, które w ciągu 3 miesięcy poprzedzających badanie wykonywały badania RTG. . Brak korelacji z objętościowymi stężeniami radonu może wynikać z małej liczebności próby. W przyszłości planowana jest kontynuacja tego kierunku badań ze zwiększeniem liczebności próby.

Wniosek

Badanie skutków długotrwałego narażenia na niskie dawki promieniowania wydaje się zadaniem trudnym, konieczność doboru próbek i kontroli powiązanych czynników może zniekształcić obraz. W prezentowanych badaniach nie udało się zidentyfikować istotnych statystycznie korelacji ze wskaźnikami objętościowej aktywności radonu, ale jednocześnie wykryte korelacje ze wskaźnikami tła gamma wskazują na perspektywy tych badań. Do badań tego typu istnieje oczywista potrzeba oceny współczynnika efektywności naprawczej osób badanych, co umożliwiłoby zróżnicowanie i porównanie osób o podobnych cechach naprawczych.

Nie ma konfliktu interesów w związku z tym badaniem.

Badanie przeprowadzono przy wsparciu finansowym Rosyjskiej Fundacji Badań Podstawowych (nr 16-34-60069\15 mol_a_dk).

Link bibliograficzny

Larionov A.V., Volobaev V.P., Serdyukova E.S. BADANIE WSKAŹNIKÓW KOMET DNA U ZDROWYCH DAWCÓW W PRZYPADKU RÓŻNYCH PARAMETRÓW PROMIENIOWANIA POMIESZCZEŃ MIESZKANIOWYCH // Współczesne problemy nauki i edukacji. – 2017 r. – nr 6.;
Adres URL: http://science-education.ru/ru/article/view?id=27215 (data dostępu: 01.02.2020). Zwracamy uwagę na czasopisma wydawane przez wydawnictwo „Akademia Nauk Przyrodniczych”

Metoda jednokomórkowej elektroforezy żelowej, zwana metodą kometową DNA, jest bardzo czuła i zapewnia wysoce wiarygodne wyniki, a jednocześnie jest stosunkowo prosta i szybka w wykonaniu oraz jest znormalizowana na szczeblu międzynarodowym (OECD nr 489). Ta metoda jest najbardziej obiecująca w rozwiązywaniu następujących problemów:

Biomonitoring człowieka i środowiska, czyli identyfikacja skutków mutagenezy indukowanej po kontakcie człowieka z ksenobiotykami (lekami, dodatkami do żywności, pestycydami, perfumami i kosmetykami, chemią gospodarczą, a także najbardziej rozpowszechnionymi zanieczyszczeniami wody, powietrza i przemysłowymi) zagrożenia, nanomateriały);

Badania onkologiczne;

Badania nad systemami naprawy DNA;

Metoda polega na rejestrowaniu różnej ruchliwości w stałym polu elektrycznym uszkodzonego DNA i/lub fragmentów DNA poszczególnych poddanych lizie komórek zamkniętych w cienkim żelu agarozowym na standardowym szkiełku. W tym przypadku DNA komórki migruje, tworząc ślad elektroforetyczny, który wizualnie przypomina „ogon komety”, którego parametry zależą od stopnia uszkodzenia DNA. Po zakończeniu elektroforezy szkiełka barwi się i analizuje za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.

Akwizycja obrazu i przetwarzanie danych odbywa się przy użyciu kompleksu sprzętowo-programowego, na który składa się bardzo czuła kamera połączona z mikroskopem i specjalistycznym oprogramowaniem.

Wszechstronne, inteligentne oprogramowanie zawarte w zestawie ten kompleks, zapewnia:

Automatyzacja analizy obrazu komet DNA „jednym naciśnięciem klawisza” obejmuje wszystkie podstawowe parametry pomiarowe m.in % DNA w ogonie komety;

- wysoka powtarzalność;

Analiza parametrów komet DNA odbywa się zarówno w czasie rzeczywistym, jak i na podstawie zapisanych obrazów cyfrowych;

Program przetwarza dane i wyświetla je w formie protokołu zgodnie z wymagania międzynarodowe dobra praktyka gospodarcza;

Analiza i porównanie danych;

Program jest w pełni zatwierdzony i zgodny z międzynarodowymi wymogami GLP. Posiada hierarchiczny dostęp i system ochrony danych.

Zestaw zawiera:

1. Fluorescencyjny mikroskop medyczny i biologiczny Nikon Eclipse Ni-E.

2. System oświetlenia epi-fluorescencyjnego o mocy 50W, zestawy filtro-dichroiczne zwierciadło-filtry do barwników DAPI, FITC, TRITC.

3. Monochromatyczna kamera wideo CCD IEEE1394 FireWire zapewniająca luminescencję. Basler Scout scA1300-32fm. Rozmiar piksela - 3,75 µm x 3,75 µm. Rozdzielczość - 1296 px x 966 px. Rozmiar czujnika wynosi 1/3 cala. Matryca – Sony. Transmisja danych poprzez szybki port - 1394 BUS. Szybkość wyświetlania klatek przy maksymalnej rozdzielczości wynosi 32 klatki/sek. Umożliwia pracę z obiektami w czasie rzeczywistym

4. Comet Assay IV - pakiet oprogramowania dla systemu Windows z generatorem arkuszy kalkulacyjnych dla programu Microsoft Excel do pracy z monochromatyczną kamerą wideo CCD IEEE1394 FireWire w czasie rzeczywistym (możliwość pomiarów i analiz zarówno na strumieniach wideo, jak i na zdjęciach), instrukcja obsługi oraz Płyta CD do instalacji i walidacji programu.

5. Licencja na rok dla czterech użytkowników.

6. Nauka na odległość przez Internet dla czterech użytkowników.

Dodatkowo oferowane:

1. Operator danych do wykorzystania Comet Assay IV w wersjach baz danych XML do filtrowania wyszukiwania oraz ekstrakcji i audytu danych poprzez bezpieczną bazę danych Oracle z zapisem w formacie MS Excel do pracy w arkuszach kalkulacyjnych. Obejmuje możliwość przeglądania automatycznie zapisanych obrazów, podpisów, danych archiwalnych i danych automatycznego audytu. Dodatkowo obejmuje możliwość eksportowania niepodpisanych i podpisanych cyfrowo danych do formatu XML. Zawiera Crypto-Key-Prov do przeglądania cyfrowo podpisanych danych w różnych formatach.

2. Menedżer dostępu do systemu GLP. Access Manager to program do monitorowania i zarządzania dostępem pracowników do baz danych. Ujednolicony system toksykologii genetycznej PI. Obejmuje kompleksowy audyt systemu. Audyt zewnętrzny. Administracja kontami użytkowników i działaniami użytkowników związanymi z programami, dostępem, hasłami, audytami itp. Używa Oracle do bezpiecznej ochrony użytkowników i kontroli danych. Pełna zgodność z ostatecznymi przepisami FDA 21 CFR część 11 dotyczącymi zapisów elektronicznych i podpisów elektronicznych.

3. Szkolenie jednego użytkownika w oparciu o instrumenty Perceptive w Wielkiej Brytanii

Genotoksyczność, czyli szkodliwy wpływ określonego związku na genom i rakotwórczość, to zjawiska powiązane. Metoda komet DNA pozwala ocenić stopień uszkodzenia genomowego DNA zarówno eksperymentalnie, do celów naukowych, jak i przy rozwiązywaniu problemów praktycznych: oceny wpływu środowiska lub warunków pracy, monitorowania materiału przeszczepionego podczas rozmrażania, w inżynierii tkankowej. Uszkodzenia DNA wykryte za pomocą testu kometowego DNA mogą wskazywać na predyspozycję do nowotworów i zmian z nimi związanych. Wzrost wykrywalnych uszkodzeń DNA komet DNA jest charakterystyczny dla komórek nowotworowych. I choć na przestrzeni kilkudziesięciu lat od jej opracowania metoda ta rozpowszechniła się jedynie w wyspecjalizowanych dziedzinach, może znaleźć zastosowanie w diagnostyce i monitorowaniu leczenia różnych chorób. Zaletami komet DNA są czułość, niskie wymagania co do ilości materiału, szybki protokół działania, względna prostota i niski koszt.

Metodę kometową DNA wykorzystuje się do badania różnych typów komórek, zarówno w hodowli, jak i w próbkach płynów biologicznych i tkanek. Głównym wymogiem analizy kometowej DNA jest przeniesienie komórek tkankowych do zawiesiny, dlatego podczas sekcji zwierząt laboratoryjnych usunięte fragmenty narządów muszą zostać poddane odpowiedniej obróbce, a komórki zawarte we krwi lub nasieniu można bezpośrednio zbadać. 80% nowotworów złośliwych ma pochodzenie nabłonkowe. Do oceny genotoksyczności metodą komet DNA najlepiej nadają się nabłonki narażone zarówno na wpływy zewnętrzne, jak i wpływy środowiska wewnętrznego organizmu. Nieinwazyjnym sposobem uzyskania ludzkich komórek nabłonkowych jest rozmaz nabłonka jamy ustnej i pobranie materiału złuszczającego z nabłonka dróg łzowych. Komórki nabłonka jamy ustnej żyją 10-14 dni, obecność w nich uszkodzonego DNA wskazuje na niedawną ekspozycję na związek genotoksyczny. Badania integralności DNA nabłonka jamy ustnej mogą pomóc w monitorowaniu narażenia na substancje powiązane działalność zawodowa i produkty spożywcze.

Komórki umieszczone w agarozie na szkle traktuje się roztworem lizującym i, jeśli to konieczne, enzymami specyficznymi dla określonych schorzeń. Rozdzielanie przeprowadza się w buforze alkalicznym. DNA opuszcza komórkę i przemieszcza się do anody, tworząc ślad widoczny pod mikroskopem fluorescencyjnym. Im więcej pęknięć występuje w DNA, tym wyraźniejszy jest ruch jego fragmentów. Po zabiegu szkiełka są neutralizowane i barwione barwnikami interkalującymi w celu uwidocznienia DNA. Ocenę ruchliwości elektroforetycznej DNA przeprowadza się za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Kiedy praktycznie całe DNA komórki ulega fragmentacji, jest to zazwyczaj komórka martwa. Jeśli pojedyncze komórki mają taki stopień uszkodzenia genomu, są wykluczane z analizy.

Najczęściej stosowany protokół zasadowej komety DNA (separacja przy pH > 13) pozwala na wykrywanie pęknięć pojedynczych nici, wiązań krzyżowych w DNA oraz pomiędzy DNA i białkami. Zastosowanie obróbki alkalicznej podczas przygotowania próbki zwiększa czułość metody, ponieważ większość środków genotoksycznych nie powoduje pęknięć dwuniciowych w łańcuchach DNA, ale tworzy pęknięcia jednoniciowe lub obszary o zwiększonej wrażliwości na zasady. Dodatkowo stosuje się enzymy, które wprowadzają pęknięcia w obszarach DNA o określonych uszkodzeniach. Glikozylaza DNA formamidopirymidyny przecina nici DNA w obszarze utlenionych nukleotydów, pirymidyn formamidowych (adeniny i guaniny z otwartym pierścieniem) i innych pochodnych guaniny; OGG1 wykrywa utlenione puryny i formamidopirymidyny, endonukleaza III wykrywa utlenione pirymidyny, endonukleaza T4 V rozpoznaje dimery pirymidyn, glikozylaza DNA 3-metyloadeniny II (AlkA) jest specyficzna dla 3-metyladeniny; a glikozylaza DNA uracylu wykrywa uracyl błędnie włączony do DNA. Takie protokoły przetwarzania materiałów mogą być potrzebne do rozwiązania konkretnych problemów, na przykład w zamrożonych tkankach wzrasta zawartość utlenionych pirymidyn i miejsc V endonukleazy T4, ale nie obserwuje się żadnych innych zaburzeń. Do oceny stanu przeszczepu przed przeszczepieniem można zastosować metodę komety DNA z zastosowaniem odpowiedniego enzymu.

Jednym z obszarów diagnostyki klinicznej, w którym wykorzystuje się technologię komet DNA, jest diagnostyka niepłodności męskiej. Ze względu na budowę plemnika zwiększa się ryzyko uszkodzenia struktury DNA w tych komórkach, a systemy naprawcze nie kompensują w pełni występujących naruszeń. W przypadku niepłodności męskiej obserwuje się zwiększony stopień uszkodzenia DNA plemników. Liczba pęknięć DNA w plemnikach zwykle osiąga około 10 6 - 10 7 na genom, zarówno u ludzi, jak i u myszy laboratoryjnych, co jest znacznie wyższą liczbą niż liczba pęknięć genomu w limfocytach lub komórkach czerwonego szpiku kostnego. Zapłodnienie plemnikiem zawierającym uszkodzenia DNA aktywuje w oocycie procesy naprawcze, które przywracają te uszkodzenia, jednak zwiększa się ryzyko mutacji i chorób wrodzonych u dziecka. Częstość poronień koreluje ze stopniem uszkodzenia DNA plemnika. Wiąże się to ze zwiększoną częstością występowania chorób wrodzonych i zaburzeń rozwojowych u dzieci z ICSI.

Metoda komety DNA służy nie tylko do oceny stanu DNA, ale także do badania procesów naprawczych w komórkach. W tym przypadku badane komórki ulegają zniszczeniu, a powstały homogenat przetwarzany jest na DNA, do którego najpierw wprowadza się uszkodzenia określonego rodzaju, a do mieszaniny dodaje się nukleotydy i ATP niezbędne do naprawy. Zdolność homogenatu do przywracania określonych uszkodzeń służy do oceny aktywności systemów naprawczych w komórkach. Rodzaj uszkodzeń wprowadzanych do DNA zależy od badanego mechanizmu naprawy. Na przykład, do oceny naprawy przez wycięcie zasady stosuje się DNA uszkodzony światłem zawierający 8-oksoguaninę, a do naprawy przez wycinanie nukleotydów stosuje się DNA napromieniany światłem ultrafioletowym zawierającym dimery pirymidyny. Pęknięcia pojedynczej nici wprowadza się poprzez działanie nadtlenkiem wodoru, naświetlanie promieniami rentgenowskimi lub gamma, a alkilację DNA przeprowadza się poprzez działanie metanosulfonianem metylu. Do badania naprawy poprzez wycinanie nukleotydów wykorzystuje się ocenę akumulacji pęknięć DNA podczas blokowania polimeraz biorących udział w tym procesie za pomocą afidokoliny lub arabinozydu cytozyny w połączeniu z hydroksymocznikiem.

Analiza ekspresji genów związanych z naprawą nie zawsze może być obiektywnym wskaźnikiem stanu DNA w komórkach, dlatego metoda komet DNA pozwala uzyskać cenne dodatkowe informacje. Zwiększona aktywność układów naprawczych wskazuje nie tylko na większą odporność komórek na uszkodzenia genomu, ale także na działanie czynnika genotoksycznego, w wyniku którego aktywowana jest synteza białek biorących udział w naprawie. Suplementacja Q10, czyli witaminy C w wolno rozpuszczających się kapsułkach, zwiększa działanie naprawcze poprzez wycinanie zasady. Podobny efekt obserwuje się, jeśli zamiast narkotyków użyjesz owoców i warzyw bogatych w przeciwutleniacze. Zmniejsza to aktywność systemu naprawy poprzez wycinanie nukleotydów, ponieważ nie jest on już potrzebny.

Test mikrojądrowy jest bezpośrednim wskaźnikiem rakotwórczości i wytyczne ICH zalecają jego stosowanie w połączeniu z DNA Comet. Technikę komety DNA można połączyć z fluorescencyjną hybrydyzacją FISH, aby określić, czy zmiany wpływają na określone regiony genomu. Do analizy dużej liczby śladów DNA uzyskanych w wyniku procedury kometowej DNA. Zalecane jest korzystanie z rozwiązań zautomatyzowanych. Pozwoli to na zmniejszenie subiektywizmu oceny i dokładniejszą ocenę wielkości i kształtu powstałych smug, co jest szczególnie istotne ze względu na konieczność gromadzenia danych o dużej liczbie smug w każdym preparacie. Kometa DNA może znaleźć zastosowanie zarówno w diagnostyce klinicznej, jak iw celach badawczych - do oceny genotoksyczności konkretnego związku.

  1. Kang SH, Kwon JY, Lee JK, Seo YR. Najnowsze postępy w badaniach genotoksyczności in vivo: przewidywanie potencjału rakotwórczego za pomocą testu kometowego i mikrojądrowego w modelach zwierzęcych / J Cancer Prev. - 2013. V.18, N.4. - s. 277-88.
  2. Rojas E, Lorenzo Y, Haug K, Nicolaissen B, Valverde M. Komórki nabłonkowe jako alternatywne ludzkie biomacierze do testu kometowego / Front Genet. - 2014. V5. N. 386.
  3. Azqueta A, Slyskova J, Langie SA, O'Neill Gaivão I, Collins A. Test kometowy do pomiaru naprawy DNA: podejście i zastosowania / Front Genet - 2014. - V.5, N.288.
  4. Aitken RJ, Bronson R, Smith TB, De Iuliis GN. Źródło i znaczenie uszkodzeń DNA w plemnikach ludzkich; komentarz do strategii diagnostycznych i błędnych przekonań / Mol Hum Reprod. - 2013. - V.19. Nr 8. - s. 475-85.

Ocena wpływu promieni gamma na DNA limfocytów metodą kometową DNA. Mikrofotografie (A) i obrazy przetworzone (B).

Wang Y, Xu C, Du LQ, Cao J, Liu JX, Su X, Zhao H, Fan F-Y, Wang B, Katsube T, Fan SJ, Liu Q. Ocena testu kometowego do oceny zależności dawka-odpowiedź DNA Uszkodzenia wywołane promieniowaniem jonizującym / Int. J. Mol. Nauka. - 2013. - V.14. N.11. - P.22449-22461.

Wpływ nadtlenku wodoru na DNA plemników mięczakówChoromytilus chór

Lafarga-De la Cruz F., Valenzuela-Bustamante M., Del Río-Portilla M., Gallardo-Escárate C. Ocena integralności genomu w plemnikach choromytilus chorus (Molina, 1782) za pomocą testu kometowego / Gayana. - 2008. - V.72. N.1. - s. 36-44.